一种改进的白藜芦醇生物生产方法技术

本发明专利技术公开了一种改进的白藜芦醇生物生产方法，其中的改进的产白藜芦醇的重组菌的构建方法，步骤：(1)全合成基因synTAL、syn4CL、synSTS；(2)制备SyBE‑002447(DE3)菌株；(3)全合成基因synaccBC‑dtsR1；(4)克隆外排蛋白基因yddG；(5)全化学合成SyBE‑217101和pSyBE‑217102；(6)将synTAL、syn4CL、synSTS与pSyBE‑217101连接，得到重组表达载体pSyBE‑synTLS；将synaccBC‑dtsR1、yddG与pSyBE‑217102连接，得到重组表达载体pSyBE‑synADY；(7)将两个重组表达载体转化到SyBE‑002447(DE3)菌株中，单克隆筛选，获得重组菌SyBEREST。本发明专利技术过表达外排蛋白促进白藜芦醇分泌，显著提升了白藜芦醇的产量，降低成本。

【技术实现步骤摘要】
一种改进的白藜芦醇生物生产方法
本专利技术所属生物医药
，涉及一种改进的产白藜芦醇的重组菌及其构建方法。
技术介绍
白藜芦醇(Resveratrol，Res)，分子式为为C14H12O3，分子量为228，易溶于氯仿、甲醇、乙酸乙酯、乙醇等有机溶剂。白藜芦醇主要有四种天然存在形式：反式白藜芦醇、顺式白藜芦醇、反式白藜芦醇苷和顺式白藜芦醇苷。作为一种多酚类天然植物抗毒素，白藜芦醇广泛存在于葡萄、花生、虎杖等70余种植物中，随着1990年“法国悖论”的提出而获得广泛关注。研究表明其具有舒张心血管、抗癌、抗氧化、抗炎、延长动物寿命等生理活性，因而可用于保健品、食品、药品和化妆品。目前白藜芦醇的获得主要有以下三种方式：(1)植物提取法：作为一种天然产物，植物提取法是目前生产白藜芦醇的主要方法，其中欧美国家主要从葡萄皮和葡萄籽中提取，而我国主要从虎杖中提取。传统的提取方法为粉碎—提取—对提取物进行提纯浓缩。但面临使用有机溶剂较多、耗时长、效率低等问题。因此随着化工行业的发展，新兴的提取工艺如CO2超临界流体萃取法、超声波提取法、微波提取法等也被开发和研究，从而实现了白藜芦醇高品质高效率地生产，但生产成本仍然很高。(2)化学合成法：以3,5-二(三甲基硅氧基)苯甲酸甲酯为起点，经Witting反应可获得白藜芦醇。目前国内主要以3,5-二羟基苯甲醇或3,5-二羟基苯甲醛为原料经5-8步合成白藜芦醇。(3)植物细胞培养法：。利用植物细胞如愈伤组织可在短时间和较小的空间内高效率的合成白藜芦醇，利用乙酸钠刺激的花生的多毛根组织可合成98μg/mg白藜芦醇。虽然上述方法已取得一定进展，但植物提取法受植物生长状况和时间空间等的限制；另一方面由于植物的大量需求和多种溶媒的大量使用，植物提取法对环境造成一定程度的危害，不符合可持续发展的理念。而化学合成法所需步骤多、产率较低且某些所需的高温高压条件不易实现等缺陷限制了其工业化生产。同时，生产过程中所用的化学试剂会对环境、生产工人甚至所生产的产品造成较严重危害，其并不是生产白藜芦醇的最理想方法。植物细胞培养法也具有细胞培养系统遗传不稳定以及诱导后和重复接种后的次级代谢物损失等缺点。近年来，随着合成生物学和代谢工程的不断发展，利用微生物成产化学品逐渐成为备受关注的方法，且如何进一步提升产量成为亟需解决的问题。目前将T7RNA聚合酶嵌入到高产酪氨酸工程菌中，并将促进白藜芦醇外排和增强丙二酰辅酶A供给两方面结合起来以提升白藜芦醇产量的方式没有任何文献报道过。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种改进的产白藜芦醇的重组菌。本专利技术的第二个目的是提供一种改进的产白藜芦醇的重组菌的构建方法。本专利技术的第三个目的是提供一种改进的白藜芦醇生物生产方法。本专利技术的技术方案概述如下：改进的产白藜芦醇的重组菌的构建方法，包括如下步骤：(1)全合成酪氨酸脱氨酶基因synTAL、4-香豆酰辅酶A连接酶基因syn4CL、芪合酶基因synSTS，synTAL的核苷酸序列如SEQIDNo.06所示；syn4CL的核苷酸序列如SEQIDNo.07所示；synSTS的核苷酸序列如SEQIDNo.08所示；(2)从大肠杆菌BL21(DE3)菌中克隆得到T7RNA聚合酶基因，通过λRed同源重组技术整合到SyBE-002447底盘菌株染色体上得到SyBE-002447(DE3)菌株；(3)全合成乙酰辅酶A羧化酶基因synaccBC-dtsR1，synaccBC-dtsR1的核苷酸序列如SEQIDNo.09所示；(4)以大肠杆菌基因组为模板，克隆外排蛋白基因yddG，yddG的核苷酸序列如SEQIDNo.10所示；(5)全化学合成以SEQIDNo.11所示的表达载体骨架SyBE-217101、以SEQIDNo.12所示的表达载体骨架pSyBE-217102；(6)将所述基因synTAL、syn4CL、synSTS与表达载体骨架pSyBE-217101通过酶切连接方式进行连接，得到重组表达载体pSyBE-synTLS；将所述基因synaccBC-dtsR1、yddG与表达载体骨架pSyBE-217102通过酶切连接方式进行连接，得到重组表达载体pSyBE-synADY；(7)将重组表达载体pSyBE-synTLS和pSyBE-synADY转化到SyBE-002447(DE3)菌株中，对单克隆筛选，获得含有重组表达载体pSyBE-synTLS和pSyBE-synADY的改进的产白藜芦醇的重组菌SyBEREST。上述方法构建的改进的产白藜芦醇的重组菌SyBEREST。一种改进的白藜芦醇生物生产方法，是用上述重组菌SyBEREST发酵制备白藜芦醇。本专利技术的优点：本专利技术过表达外排蛋白促进白藜芦醇分泌，增强重要前体丙二酰辅酶A以进一步提升白藜芦醇产量。本专利技术显著提升了白藜芦醇的产量，同时降低了生产成本，有利于工业上进一步扩大生产。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步的说明。本专利技术改进的白藜芦醇合成途径属于植物苯丙烷代谢途径：以甘油或葡萄糖为碳源，为生长提供必需的能量来源及乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A。甘油或葡萄糖经代谢合成酪氨酸，再经酪氨酸脱氨酶(TAL)催化合成对香豆酸，继而经4-香豆酰辅酶连接酶(4CL)催化生成对香豆酰辅酶A，再经芪合酶(STS)将1分子对香豆酰辅酶A与3分子丙二酰辅酶A缩合成1分子白藜芦醇。在此过程中，本专利技术通过过表达转运蛋白促进白藜芦醇外排，引入外源乙酰辅酶A羧化酶增强重要前体丙二酰辅酶A供给，逐步提升白藜芦醇产量。本专利技术所使用原始高产酪氨酸底盘菌株，名称为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)SyBE-002447，现于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.7962。保藏时间为2013年7月22日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。本专利技术所使用大肠杆菌菌株E.coliBL21(DE3)和E.coliDH5α购买自北京全式金生物技术有限公司。本专利技术所使用pKD46质粒,pCP20质粒和pKD3质粒购买自普如汀生物技术(北京)有限公司。实施例1：酪氨酸脱氨酶TAL，4-香豆酰辅酶A连接酶4CL，芪合酶STS，乙酰辅酶A羧化酶亚基accBC，dtsR1基因设计设计优选黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)来源的酪氨酸脱氨酶TAL；拟南芥(Arabidopsisthaliana)来源的4-香豆酰辅酶连接酶4CL；葡萄(Vitisvinifera)来源的芪合酶STS；谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)来源的乙酰辅酶A羧化酶亚基AccBC，DtsR1，上述几种酶的氨基酸序列依次分别如序列表中SEQIDNo.1，SEQIDNo.2，SEQIDNo.3，SEQIDNo.4，SEQIDNo.5所示。使用JCAT在线密码子优化软件(http：//www.jcat.de)结合OPTIMIZER密码子优化工具(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)，以大肠杆菌对密码子的偏好性进行优化，设计全长synTAL、s本文档来自技高网...

【技术保护点】
改进的产白藜芦醇的重组菌的构建方法，其特征包括如下步骤：(1)全合成酪氨酸脱氨酶基因synTAL、4‑香豆酰辅酶A连接酶基因syn4CL、芪合酶基因synSTS，synTAL的核苷酸序列如SEQ ID No.06所示；syn4CL的核苷酸序列如SEQ ID No.07所示；synSTS的核苷酸序列如SEQ ID No.08所示；(2)从大肠杆菌BL21(DE3)菌中克隆得到T7RNA聚合酶基因，通过λRed同源重组技术整合到SyBE‑002447底盘菌株染色体上得到SyBE‑002447(DE3)菌株；(3)全合成乙酰辅酶A羧化酶基因synaccBC‑dtsR1，synaccBC‑dtsR1的核苷酸序列如SEQ ID No.09所示；(4)以大肠杆菌基因组为模板，克隆外排蛋白基因yddG，yddG的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；(5)全化学合成以SEQ ID No.11所示的表达载体骨架SyBE‑217101、以SEQ ID No.12所示的表达载体骨架pSyBE‑217102；(6)将所述基因synTAL、syn4CL、synSTS与表达载体骨架pSyBE‑217101通过酶切连接方式进行连接，得到重组表达载体pSyBE‑synTLS；将所述基因synaccBC‑dtsR1、yddG与表达载体骨架pSyBE‑217102通过酶切连接方式进行连接，得到重组表达载体pSyBE‑synADY；(7)将重组表达载体pSyBE‑synTLS和pSyBE‑synADY转化到SyBE‑002447(DE3)菌株中，对单克隆筛选，获得含有重组表达载体pSyBE‑synTLS和pSyBE‑synADY的改进的产白藜芦醇的重组菌SyBEREST。...

【技术特征摘要】
1.改进的产白藜芦醇的重组菌的构建方法，其特征包括如下步骤：(1)全合成酪氨酸脱氨酶基因synTAL、4-香豆酰辅酶A连接酶基因syn4CL、芪合酶基因synSTS，synTAL的核苷酸序列如SEQIDNo.06所示；syn4CL的核苷酸序列如SEQIDNo.07所示；synSTS的核苷酸序列如SEQIDNo.08所示；(2)从大肠杆菌BL21(DE3)菌中克隆得到T7RNA聚合酶基因，通过λRed同源重组技术整合到SyBE-002447底盘菌株染色体上得到SyBE-002447(DE3)菌株；(3)全合成乙酰辅酶A羧化酶基因synaccBC-dtsR1，synaccBC-dtsR1的核苷酸序列如SEQIDNo.09所示；(4)以大肠杆菌基因组为模板，克隆外排蛋白基因yddG，yddG的核苷酸序列如SEQIDNo.10所示；(5)全化学合成以SEQIDNo.11所示的表达载体骨架Sy...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵广荣，赵莹，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12