一种体外快速优化菌株代谢通路的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体公开了一种体外快速优化菌株代谢通路的方法。本发明专利技术利用Cre‑loxP位点特异性重组的特性，通过在功能基因片段和接收载体引入改进的loxPsym序列实现基因的随机插入，从而获得随机插入的DNA，形成多样性的重排质粒文库，能够实现多个代谢通路功能基因的随机组合，避免各功能基因合成长片段DNA的过程，高效快速的实现多个功能基因的联合分析，快速优化代谢通路，寻找关键基因并且不受宿主限制，应用领域广。

【技术实现步骤摘要】
一种体外快速优化菌株代谢通路的方法
本专利技术涉及生物
，更具体的说是涉及一种体外快速优化菌株代谢通路的方法。
技术介绍
DNA测序技术的普及，揭示了越来越多物种的全基因组信息，此外，转录组、蛋白质组、代谢组等相关组学技术的发展使得科学家们对生物细胞内各种复杂的代谢通路以及精细的调控机制有了更深刻的认知。例如酿酒酵母生产β-胡萝卜素的必须基因元件为GGPP合酶基因crtE、八氢番茄红素合成酶基因crtB、八氢番茄红素脱氢酶基因crtI以及番茄红素环化酶基因crtY；酿酒酵母生产番茄红素的必须基因元件为GGPP合酶基因crtE、八氢番茄红素合成酶基因crtB和八氢番茄红素脱氢酶基因crtI；酿酒酵母生产紫色杆菌素的必须基因元件为vioA、vioB、vioC、vioD和vioE。合成生物学的深入研究加速了绿色无污染有机化学品细胞工厂的开发。在工业菌株的改良上，已经可以通过摸索发酵条件、优化细胞代谢通路等措施来降低成本、提高产量。在微生物工业中，虽然生产的化学品性质各异，对工业菌株的要求也各不相同，但商业目的都是在同等生产条件下获得相对高产的菌株。在长期生产实践中，对工业菌株已经摸索到最佳的发酵条件，单纯通过改变外界环境提高产量上升空间不大，必须对菌株自身进行根本性改良，即改造菌株的基因。传统基因工程，往往通过改变代谢通路中的某个基因的表达水平，或通过调控机制的优化来提高产量，但存在成本高和研发周期久、资源消耗大的缺点。在许多情况下，编码相关生物合成酶的基因多是未知的，并且常常出现于一个操纵子中或以基因簇的形式出现。而且参与生物合成的酶又常常是一些多酶复合体系，因此利用常规蛋白质工程或体外定向进化技术，很难对这些生物合成途径进行理性化的改造以提高产量或产生新的同系物，因为除了蛋白质工程的难度外，测定途径的限速步骤是非常费力和不确定的。而DNA重排则非常适合于优化这样的途径，因为整个代谢途径能当作一个单元进行进化，而无需了解限速步骤以及对蛋白质的结构和功能方面更为详细的分析。利用DNA重排，通过多种突变，可以有效协调一个代谢途径中不同的相互作用，使总的代谢效果迅速进化，这是其他策略所无法完成的。由于位点特异性重组系统具有高效精确的优点,在基因工程领域得到了广泛的应用。位点特异性重组酶识别特定的位点形成联会复合体，并发生DNA链的切割与交换，实现靶位点之间的整合、切离或倒位。这一过程由位于重组酶催化活性中心的酪氨酸或丝氨酸向DNA磷酸骨架发起攻击，形成共价中间体，不需要高能量辅助因子的参与。目前，位点特异性重组酶做为工具酶的体外应用主要有Creator系统和基于λ整合的Gateway系统。Gateway系统在Int和IHF的作用下attB和attP发生重组，再加入Xis即发生attL和attR之间的逆向重组。利用这一原理和一对突变的位点，Hartley等人设计了通过两步克隆高效快速构建表达载体的Gateway系统。同时其载体上均带有自杀基因ccdB，宿主只有正确重组克隆转入后才能生长,方便筛选。Creator系统设计类似Gateway系统，二者均应用于基因克隆和表达，但仅能针对单个基因进行功能性研究，同时基因重排的多样性也不够丰富。因此，亟待开发一种可以针对多个基因功能联合研究的体外随机重组方法，增加基因重排的多样性，以此可以快速优化菌株的代谢通路，高效快速实现多个功能基因的联合分析，指导以后的菌株构建工作。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种体外快速优化菌株代谢通路的方法，能够针对多个菌株代谢通路功能基因进行体外重排，丰富基因重排的多样性，避免各功能基因合成长片段DNA的过程，高效快速实现多个功能基因的联合分析。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：一种体外快速优化菌株代谢通路的方法，包括：步骤1、利用GoldenGate组装方法将菌株代谢通路的各功能基因分别引入到包含SEQIDNO:1所示核苷酸序列和筛选标签1的供体质粒上，通过酶切形成各功能基因片段，所述功能基因片段两端为SEQIDNO:1所示核苷酸序列，中间为功能基因和筛选标签1；步骤2、将各功能基因片段与含有筛选标签2和SEQIDNO:1所示核苷酸序列的接收载体、Cre酶、Cre酶缓冲液和ddH2O混合构成反应体系，温控开启重排，然后使Cre酶失活关闭重排，获得重排的质粒文库；步骤3、将重排的质粒文库转化到出发菌株中，在步骤1所述筛选标签对应的培养基上进行培养，选择与出发菌株相比颜色差异明显、菌落较大的菌株作为潜在高产菌株并测定代谢通路对应的化学品产量，确定正确高产菌株；步骤4、提取正确高产菌株的重排质粒进行结构分析，获得优化后代谢通路的信息。Cre/loxP重组酶系统常用于基因打靶，其中的LoxP位点来源于P1噬菌体，是由两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列确定了LoxP的方向，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程，当两个loxP方向一致时，位于两个loxP中间的序列只能发生删除；当两个loxP方向相反时，位于两个loxP中间的序列只能发生反转，当两条DNA间的loxP发生重排时会导致两条DNA发生移位。本专利技术调整LoxP位点8bp的间隔序列ATGTATGC为ATGTACAT，使间隔序列消除了方向性，没有方向的loxP位点(SEQIDNO:1所示核苷酸序列的loxPsym)，删除、翻转、移位、复制等情形不必局限于之前的限制，均有几率发生，可大大增加重排组合的多样性。借助上述没有方向的loxP位点特性，本专利技术在代谢通路的各功能基因片段和接收载体上各自引入改进的SEQIDNO:1所示核苷酸序列，不仅各功能基因片段和接收载体本身可以发生DNA重排，并且各功能基因片段本和接收载体之间也有可能发生不确定的DNA重排，将功能基因的插入更加随机化和多样化，从而获得多样性的重排质粒文库，相比需要将代谢通路各功能基因合成为长片段DNA再进行重排，本专利技术这种方法更加简便、省时，并且丰富多样化。在本专利技术中，所述步骤1具体为：由商业载体pUC19出发，通过overlapPCR扩增出由SEQIDNO:1所示核苷酸序列、BsaI酶切位点、RFP、BsaI酶切位点、URA基因、SEQIDNO:1所示核苷酸序列顺次拼接的DNA序列，然后将该DNA序列插入到pUC19质粒多克隆位点处组装成为供体质粒，该供体质粒可以将外源基因利用RFP两端的BsaI酶切位点快速替换RFP基因，从而快速添加筛选标签1和功能基因片段，在构建的供体质粒基础上，利用GoldenGate组装方法，将功能基因片段与筛选标签1两端快速添加SEQIDNO:1所示核苷酸序列之间。功能基因片段的完整转录单元使用PCR方法或者化学合成的方法获得，使其两侧末端携带与供体质粒匹配的BsaI酶切位点，通过GoldenGate组装的方法将目的功能基因片段的转录单元连接到供体质粒上，然后通过限制性内切酶，如NotI酶切获得包含SEQIDNO:1所示核苷酸序列和筛选标签1的功能基因片段。本专利技术所述代谢通路可指代生成任何化学品的代谢通路，生产β-胡萝卜素的代谢通路、生产番茄红素的代谢通路和生产紫色杆菌素本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外快速优化菌株代谢通路的方法，其特征在于，包括：步骤1、利用Golden Gate组装方法将菌株代谢通路的各功能基因分别引入到包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列和筛选标签1的供体质粒上，通过酶切形成各功能基因片段，所述功能基因片段两端为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，中间为功能基因和筛选标签1；步骤2、将各功能基因片段与含有筛选标签2和SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的接收载体、Cre酶、Cre酶缓冲液和ddH2O混合构成反应体系，温控开启重排，然后使Cre酶失活关闭重排，获得重排的质粒文库；步骤3、将重排的质粒文库转化到出发菌株中，在步骤1所述筛选标签对应的培养基上进行培养，选择与出发菌株相比颜色差异明显、菌落较大的菌株作为潜在高产菌株并测定代谢通路对应的化学品产量，确定正确高产菌株；步骤4、提取正确高产菌株的重排质粒进行结构分析，获得优化后代谢通路的信息。

【技术特征摘要】
1.一种体外快速优化菌株代谢通路的方法，其特征在于，包括：步骤1、利用GoldenGate组装方法将菌株代谢通路的各功能基因分别引入到包含SEQIDNO:1所示核苷酸序列和筛选标签1的供体质粒上，通过酶切形成各功能基因片段，所述功能基因片段两端为SEQIDNO:1所示核苷酸序列，中间为功能基因和筛选标签1；步骤2、将各功能基因片段与含有筛选标签2和SEQIDNO:1所示核苷酸序列的接收载体、Cre酶、Cre酶缓冲液和ddH2O混合构成反应体系，温控开启重排，然后使Cre酶失活关闭重排，获得重排的质粒文库；步骤3、将重排的质粒文库转化到出发菌株中，在步骤1所述筛选标签对应的培养基上进行培养，选择与出发菌株相比颜色差异明显、菌落较大的菌株作为潜在高产菌株并测定代谢通路对应的化学品产量，确定正确高产菌株；步骤4、提取正确高产菌株的重排质粒进行结构分析，获得优化后代谢通路的信息。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1为：由商业载体pUC19出发，通过overlapPCR扩增出由SEQIDNO:1所示核苷酸序列、BsaI酶切位点、RFP、BsaI酶切位点、SEQIDNO:1所示核苷酸序列顺次拼接的DNA序列，然后将该DNA序列插入到pUC19质粒多克隆位点处组装成为供体质粒，该供体质粒可以将外源基因利用RFP两端的BsaI酶切位点快速替换RFP基因，从而快速添加筛选标签1和功能基因片段，在构建的供体质粒基础上，利用GoldenGate组装方法，将功能基因片段与筛选标签1两端快速添加SEQIDNO:1所示核苷酸序列之间。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述代谢通路的各功能基因为生产β-胡萝卜素的代谢通路的各功能基因、生产番茄红素的代谢通路的各功能基因或生产紫色杆菌素的代谢通路的各功能基因。4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述生产β-胡萝卜素的代谢通路的各功能基因为tHMG1、crtI、crtYB、crtE、ERG10、ERG12、ERG8、ERG19、ERG20、BTS1和ERG13。5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2为：将各功能基因片段与含有loxPsym序列和筛选标签2的接收...

【专利技术属性】
技术研发人员：元英进，吴毅，朱瑞莹，刘瑞，马璐，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12