一种从发酵液中分离提纯西罗莫司的方法技术

本发明专利技术提供了一种从发酵液中分离提纯西罗莫司的方法，其采用冷冻破壁，有机溶剂加热浸提冷冻破壁处理后的菌丝体，及对西罗莫司粗品进行动态轴向高压层析柱进行分离，洗脱剂梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液进行浓缩后的得浓缩液，并采用两次有机溶剂溶解结晶得到西罗莫司。本发明专利技术所揭示的一种从发酵液中分离提纯西罗莫司的方法，降低了从发酵液中分离并纯化西罗莫司的生产成本，避免了两次硅胶柱层析，从而简化了西罗莫司的纯化工艺，大大降低了柱损耗液大等缺陷，因此比较适合于工业化量产。

【技术实现步骤摘要】
一种从发酵液中分离提纯西罗莫司的方法
本专利技术涉及生物制药
，尤其涉及一种从发酵液中分离提纯西罗莫司的方法。
技术介绍
西罗莫司(Sirolimus)也称雷帕霉素(Rapamycin)，是1975年由Veniza等分离得到的吸水链霉菌所产的大环内脂类抗生素。经过多年的研究，西罗莫司现已开发成为临床使用的强效免疫抑制。同时以西罗莫司为前体，化学修饰合成的一些结构新颖衍生物，被发现在免疫抑制、抗癌、抗帕金森综合征与艾滋病等方面上，具有新的治疗作用，其中其合成物Temsirolimus、Everolimus、AP23573已作为抗肿瘤靶向新药物进行临床研究，西罗莫司在医药应用领域具有广泛前景。杨国新等在《海峡药学》(2007年，第19卷第17期，25-26页)文献中公开：发酵液经离心后得到菌丝体，菌丝体用两倍量体积的95％酒精分别浸泡2次，离心弃菌丝渣，合并酒精浸泡液，减压浓缩去除酒精。残留液用等体积的乙酸乙酯分别萃取2次，合并乙酸乙酯层，并用饱和NaCl溶液洗涤1次，经无水Na2SO4干燥1h后，过滤，减压浓缩除去乙酸乙酯得上柱物。上柱物溶于适当体积的洗脱剂(乙酯-石油醚洗脱系统)，200～300目硅胶柱层析分段收集，HPLC检测，合并含西罗莫司的洗脱液，减压浓缩，浓缩液经乙醚结晶，洗晶，结晶，经上述制备的西罗莫司结晶溶于少量的洗脱剂，硅胶(200～300目)柱层析分离，分步收集，分离过程用高效液相跟踪检测。合并含西罗莫司的洗脱液，减压浓缩，浓缩液经乙醚结晶，洗晶，重结晶得到高纯度的西罗莫司样品。从上述文献资料所公开的从发酵液中提取并纯化西罗莫司的工艺中，我们可以看到西罗莫司的粗制纯度提高到95％，精制纯度提高到了99.8％以上，或者是单杂以及总杂的含量也降到了0.1％和1％以下，但是其提取纯化过程处理工艺繁琐，时间周期长，尤其是经历两次硅胶柱层析，存在分离提纯成本较高、柱损耗液大等缺陷，从而大大降低了西罗莫司的收率。因此，提供一种生产成本低廉、适合于工业化生产的提纯西罗莫司的生产方法迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术的目的在于公开一种从发酵液中分离提纯西罗莫司的方法，用以降低从发酵液中分离并纯化西罗莫司的生产成本，以简化西罗莫司的纯化工艺，并提出一种适于工业化量产的方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供了一种从发酵液中分离提纯西罗莫司的方法，包括以下步骤：(1)向西罗莫司发酵液中加入助滤剂进行搅拌30～45分钟后，板框过滤收集菌丝体；(2)将菌丝体置于冷冻环境中冷冻破壁3～5小时；(3)使用有机溶剂加热浸提冷冻破壁处理后的菌丝体1～2次，每次浸提4～6小时，过滤合并浸提液，于-0.06MPa～0.1MPa的条件下减压浓缩后得到浓缩液；(4)对步骤(3)所得的浓缩液使用非极性大孔树脂吸附，洗脱剂梯度洗脱，收集洗脱液；(5)将洗脱液转移至浓缩罐中，并向浓缩罐中加入有机溶剂进行萃取，收集萃取液；(6)向萃取液中加入活性炭，搅拌30～60分钟后过滤并收集过滤液；(7)将过滤液进行减压浓缩，直至蒸出的滤液不含有机溶剂，收集浓缩液；(8)对步骤(7)所得的浓缩液使用有机溶剂溶解，充分搅拌后在低温条件下吸晶，得吸晶液，对吸晶液过滤后得到西罗莫司粗品；(9)对西罗莫司粗品进行动态轴向高压层析柱进行分离，洗脱剂梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液进行浓缩后的得浓缩液；(10)对步骤(9)所得的浓缩液使用有机溶剂溶解，结晶得到西罗莫司半成品；(11)对步骤(10)所得西罗莫司半成品使用有机溶剂溶解，结晶得到西罗莫司成品。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤(3)的有机溶剂选自乙酸乙酯、乙醇或者丙酮中的一种或者两种以上任意比例的混合物；所述步骤(5)中的有机溶剂选自乙酸乙酯或者氯仿；所述步骤(8)与步骤(10)中的有机溶剂选自石油醚或者环己烷；所述步骤(11)中的有机溶剂选自乙酸乙酯或者乙醚。作为本专利技术的进一步改进，所述非极性大孔树脂选自X-5、D1300或HZ818。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤(4)中的洗脱剂为含有20wt％～60wt％丙酮的水溶液或者含有30wt％～70％wt乙醇的水溶液；所述步骤(9)中的洗脱剂为含25wt％～40wt％丙酮的正己烷混合液或者含有30wt％～50wt％乙酸乙酯的石油醚混合液。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤(6)中按升萃取液添加0.01～0.02公斤活性炭的比例添加活性炭。作为本专利技术的进一步改进，所述活性炭选自医用针型活性炭或者864活性炭。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤(8)中有机溶剂的添加量为浓缩液体积的1～3倍。作为本专利技术的进一步改进，所述动态轴向高压层析柱中的筛板粒径10um，柱高100cm，直径10cm，径高比为1:10。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤(1)中的助滤剂选自硅藻土或者珍珠岩中的一种或者其混合物。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤(1)中助滤剂的添加量为西罗莫司发酵液的体积的1～4％。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术所揭示的一种从发酵液中分离提纯西罗莫司的方法，降低了从发酵液中分离并纯化西罗莫司的生产成本，避免了两次硅胶柱层析，从而简化了西罗莫司的纯化工艺，大大降低了柱损耗液大等缺陷，因此比较适合于工业化量产。附图说明图1实施例一所分离提纯得到的西罗莫司的高效液相色谱图；图2实施例二所分离提纯得到的西罗莫司的高效液相色谱图；图3实施例三所分离提纯得到的西罗莫司的高效液相色谱图。具体实施方式下面结合各实施方式对本专利技术进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本专利技术的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代，均属于本专利技术的保护范围之内。除非说明书中有特殊说明，本专利技术中的各个实施例中的组分、原料均采用分析纯级别。另外，各实施例中的“g”为重量单位“克”；“ml”为体积单位“毫升”；“室温”为23℃。“wt％”为浓度单位“质量百分比”。实施例一：一种从发酵液中分离提纯西罗莫司的方法，包括以下步骤：(1)向西罗莫司发酵液中加入助滤剂进行搅拌30～45分钟后，板框过滤收集菌丝体。助滤剂选自硅藻土，且助滤剂的添加量为西罗莫司发酵液的体积的1％。(2)将菌丝体置于冷冻环境中冷冻破壁3～5小时。(3)使用有机溶剂加热浸提冷冻破壁处理后的菌丝体1～2次，每次浸提4～6小时，过滤合并浸提液，于-0.06MPa～0.1MPa的条件下减压浓缩后得到浓缩液。所述步骤(3)的有机溶剂选自乙酸乙酯。(4)对步骤(3)所得的浓缩液使用非极性大孔树脂吸附，洗脱剂梯度洗脱，收集洗脱液。具体的，该非极性大孔树脂选自D1300。所述步骤(4)中的洗脱剂为含有20wt％～60wt％丙酮的水溶液，并更优选为30wt％丙酮的水溶液。(5)将洗脱液转移至浓缩罐中，并向浓缩罐中加入有机溶剂进行萃取，收集萃取液。步骤(5)中的有机溶剂为乙酸乙酯。(6)向萃取液中加入活性炭，搅拌30～60分钟后过滤并收集过滤液。具体的，所述步骤(6)中按升萃取液添加0.01公斤活性炭的比例添加活性炭。其中，活性炭选自医用针型活性炭。(7)将过滤液进行减压浓缩，直至蒸出的滤液不含有机溶剂，收集浓缩液。(8)对步骤(7)所得的浓缩液使用有机溶剂溶解，充分搅拌后在低温条件下吸晶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从发酵液中分离提纯西罗莫司的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)向西罗莫司发酵液中加入助滤剂进行搅拌30～45分钟后，板框过滤收集菌丝体；(2)将菌丝体置于冷冻环境中冷冻破壁3～5小时；(3)使用有机溶剂加热浸提冷冻破壁处理后的菌丝体1～2次，每次浸提4～6小时，过滤合并浸提液，于‑0.06MPa～0.1MPa的条件下减压浓缩后得到浓缩液；(4)对步骤(3)所得的浓缩液使用非极性大孔树脂吸附，洗脱剂梯度洗脱，收集洗脱液；(5)将洗脱液转移至浓缩罐中，并向浓缩罐中加入有机溶剂进行萃取，收集萃取液；(6)向萃取液中加入活性炭，搅拌30～60分钟后过滤并收集过滤液；(7)将过滤液进行减压浓缩，直至蒸出的滤液不含有机溶剂，收集浓缩液；(8)对步骤(7)所得的浓缩液使用有机溶剂溶解，充分搅拌后在低温条件下吸晶，得吸晶液，对吸晶液过滤后得到西罗莫司粗品；(9)对西罗莫司粗品进行动态轴向高压层析柱进行分离，洗脱剂梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液进行浓缩后的得浓缩液；(10)对步骤(9)所得的浓缩液使用有机溶剂溶解，结晶得到西罗莫司半成品；(11)对步骤(10)所得西罗莫司半成品使用有机溶剂溶解，结晶得到西罗莫司成品。...

【技术特征摘要】
1.一种从发酵液中分离提纯西罗莫司的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)向西罗莫司发酵液中加入助滤剂进行搅拌30～45分钟后，板框过滤收集菌丝体；(2)将菌丝体置于冷冻环境中冷冻破壁3～5小时；(3)使用有机溶剂加热浸提冷冻破壁处理后的菌丝体1～2次，每次浸提4～6小时，过滤合并浸提液，于-0.06MPa～0.1MPa的条件下减压浓缩后得到浓缩液；(4)对步骤(3)所得的浓缩液使用非极性大孔树脂吸附，洗脱剂梯度洗脱，收集洗脱液；(5)将洗脱液转移至浓缩罐中，并向浓缩罐中加入有机溶剂进行萃取，收集萃取液；(6)向萃取液中加入活性炭，搅拌30～60分钟后过滤并收集过滤液；(7)将过滤液进行减压浓缩，直至蒸出的滤液不含有机溶剂，收集浓缩液；(8)对步骤(7)所得的浓缩液使用有机溶剂溶解，充分搅拌后在低温条件下吸晶，得吸晶液，对吸晶液过滤后得到西罗莫司粗品；(9)对西罗莫司粗品进行动态轴向高压层析柱进行分离，洗脱剂梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液进行浓缩后的得浓缩液；(10)对步骤(9)所得的浓缩液使用有机溶剂溶解，结晶得到西罗莫司半成品；(11)对步骤(10)所得西罗莫司半成品使用有机溶剂溶解，结晶得到西罗莫司成品。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)的有机溶剂选自乙酸乙酯、乙醇或者丙酮中的一种或者两种以上任意比例的混合物；所述步骤(5)...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵永俊，付静，郑缘，游云龙，金丹甜，徐新冬，吴东奇，王同意，
申请(专利权)人：无锡福祈制药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32