一种快速构建高通量测序文库的试剂及方法及其应用技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及一种快速构建高通量测序文库的试剂及方法及其应用。本发明专利技术的高通量文库构建试剂中包括核酸释放剂，核酸释放剂作为缓冲体系，核酸可以有效从样本中释放，且无需纯化直接用于高通量测序文库构建。由此，可以简化纯化步骤，提高建库效率；而反应终止试剂既可以有效的终止转座反应，又无需纯化，还能有效地用于后续处理，磁珠活化试剂可以有效的活化磁珠，使磁珠重新获得吸附核酸片段的能力。本发明专利技术所提供的高通量测序文库构建方法，是真正意义上的一管式操作，快速，步骤简便，易于操作，结果重复性好，同时可避免样本间污染和样本混样。

A reagent and method for rapid construction of high throughput sequencing library and its application

The invention belongs to the field of molecular biology technology, in particular to a reagent, method and application of rapid construction of high throughput sequencing library. The high throughput library construction reagents of the invention include nucleic acid releasing agents, nucleic acid releasing agents as buffer systems, nucleic acids can be effectively released from samples, and need not be purified directly for high-throughput sequencing library construction. This can simplify the purification steps, efficiency; and reaction reagent can effectively terminate termination of transposition reaction without purification, can be effectively used for subsequent processing, bead activation reagent can activate the beads effectively, the ability to regain the beads adsorption section of nucleic acid. The construction method of the high-throughput sequencing library provided by the invention is a tube like operation in a real sense, fast and simple, easy to operate, and has good reproducibility, and avoids contamination between samples and sample mixing.

【技术实现步骤摘要】
一种快速构建高通量测序文库的试剂及方法及其应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种快速构建高通量测序文库的试剂及方法及其应用。
技术介绍
核酸是生命遗传信息的载体，而对遗传信息解读的方法和手段不尽相同。近年来兴起的第二代测序技术，以其高通量和高准确性的特点，为基因表达和调控等生物学基础研究提供重要数据，同时也为疾病诊断分析和基因治疗等方法应用提供了重要支持。然而，目前常用的高通量测序平台，均需进行测序文库构建。而文库构建流程中，既需对样本进行核酸提取纯化，又需高浓度高纯度核酸模板，且均涉及到分离纯化。因此，整个过程繁琐复杂、中间产物过多、耗时、成本高。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种快速构建高通量测序文库的试剂及方法及其应用，目的是简便快速地进行核酸提取和文库构建相整合。本专利技术的快速构建高通量测序文库的试剂包括核酸释放剂、反应终止液和磁珠活化剂；其中所述的核酸释放剂包括：5～500mM(pH7.0～9.0的Tris-HCl、50～1000mMNaCl、0.1～10mMEDTA、质量/体积比0.01％～2％的十二烷基磺酸钠(SDS)、质量/体积比0.04％～3％的十二烷基硫酸锂(LLS)、0.01％～2％质量/体积比0.01～2％的甜菜碱和质量/体积比0.2-1.5％的BSA，其中的体积百分比以无菌水体积为计算基准；所述的反应终止液包括：0.1～100mMEDTA、质量/体积比为0.1～5％的SDS和pH7.0～9.0的15～500mMTris-HCl；所述的磁珠活化剂包括100～5000mMNH4OH，25mM～500mMKCl，pH5.0-9.0。本专利技术还提供一种快速高通量测序文库构建的方法，该方法按照以下步骤进行：(1)样本核酸释放，使用核酸释放剂对样本进行处理，获得文库构建的模板；(2)在步骤(1)后直接加入核酸吸附磁珠，对释放的核酸进行富集；(3)在步骤(2)后直接加入转座酶体系，对富集在磁珠上的核酸进行片段化及特异性接头添加到核酸片段两端；(4)在步骤(3)后直接加入反应终止液，终止转座反应，为后续的文库扩增做准备；(5)在步骤(4)直接加入扩增体系进行文库的放大；(6)在步骤(5)后直接加入磁珠活化剂，使磁珠重新获得吸附核酸的能力，同时对扩增后的文库进行纯化，纯化后的产物即为上机文库。本专利技术的高通量文库构建方法，可以用于Roche、Illumina、ThermoFisher、PacificBiosciences、华大基因、OxfordNanoporeTechnologies、华因康、瀚海基因等高通量测序平台。所述的样本类型包括人类的全血、新鲜组织、石蜡包埋组织(FFPE)、口腔脱落细胞、细胞系、粪便、尿液以及其它体液，以及其它动物物种、植物、细菌和病毒。与现有技术相比，本专利技术的特点和有益效果是：本专利技术的高通量文库构建试剂中包括核酸释放剂，核酸释放剂作为缓冲体系，核酸可以有效从样本中释放，且无需纯化直接用于高通量测序文库构建。由此，可以简化纯化步骤，提高建库效率；而反应终止试剂既可以有效的终止转座反应，又无需纯化，还能有效地用于后续处理，磁珠活化试剂可以有效的活化磁珠，使磁珠重新获得吸附核酸片段的能力。本专利技术所提供的高通量测序文库构建方法，是真正意义上的一管式操作，快速，步骤简便，易于操作，结果重复性好，同时可避免样本间污染和样本混样。本专利技术的高通量文库构建方法，可以用于Roche、Illumina、ThermoFisher、PacificBiosciences、华大基因、OxfordNanoporeTechnologies、华因康、瀚海基因等高通量测序平台。本专利技术适用的样本类型包括人类的全血、新鲜组织、石蜡包埋组织(FFPE)、口腔脱落细胞、细胞系、粪便、尿液以及其它体液。同时可用于其它动物物种、植物、细菌以及病毒等。本专利技术构建的文库，既可直接上机测序，又可作为预文库用于后续捕获等实验。本专利技术的核酸释放剂，可以完成核酸的有效释放，优于传统文库构建方法中所需高纯化的核酸样本，适用性广，易于推广；本专利技术引入转座酶建库方案，大大简化了建库流程；本专利技术的转座反应终止液，可以省去转座后的纯化步骤，大大节省了实验时间，提高建库效率；本专利技术的磁珠活化剂，可以实现磁珠重复利用，减低建库成本，简化纯化步骤；提供的建库方法，可以用于不同的测序平台，适用性广，易于推广。附图说明图1是本专利技术建立快速构建高通量测序文库的流程图；图2是本专利技术实施例2％琼脂糖凝胶电泳检测文库结果；图3是本专利技术实施例2采用传统方法构建文库的2％琼脂糖凝胶电泳检测文库结果。具体实施方式现以Illumina平台为例，结合实施例对本专利技术进一步说明。实施例1：本实施例进行人类全血样本高通量文库快速构建及测序分析。本实施例中快速构建高通量测序文库的试剂包括核酸释放剂、反应终止液和磁珠活化剂；其中所述的核酸释放剂包括：250mM(pH7.0～9.0的Tris-HCl、50mMNaCl、0.1EDTA、0.01％SDS、0.04％LLS、0.01％甜菜碱和0.2％BSA；所述的反应终止液包括：50mMEDTA、0.1％SDS和pH7.0～9.0的15mMTris-HCl；所述的磁珠活化剂包括5000mMNH4OH，500mMKCl，pH5.0-9.0。本实施例快速高通量测序文库构建的方法，如图1所示，按照以下步骤进行：(1)样本核酸释放：将一份全血样本，按照相应类型的样本预处理方法进行离心操作，离心后，吸取200μL于1.5mL离心管中，再加入200μL核酸释放剂，涡旋混匀，瞬时离心，在80～100℃下孵育5～30min，室温静置5min，获得文库构建的模板；(2)在步骤(1)后直接加入50μL核酸吸附磁珠，对释放的核酸进行富集，涡旋混匀，室温静置10min后，置于磁力架上，弃上清，将磁珠转至新的0.2mLPCR管中，保存以备用；(3)在步骤(2)后直接加入转座酶体系，对富集在磁珠上的核酸进行片段化及特异性接头添加到核酸片段两端，转座反应涡旋震荡混匀，瞬时离心，55℃孵育15～30min，孵育结束后加入5μL反应终止液，涡旋震荡混匀，瞬时离心；其中转座酶复合物组装按照下表：成分浓度/体积转座酶8μLAdaptor1-Core5μLAdaptor2-Core5μL组装缓冲液2μL总体积20μL指尖轻弹混匀，瞬时离心，25℃孵育90min，复合物于4℃保存；Adaptor1-Core与Adaptor2-Core的组装：将Adaptor1与Core以及Adaptor2与Core分别在退火缓冲液中完成退火，完成退火后的Adaptor1-Core和Adaptor2-Core用于转座酶的组装；其中：Adaptor1、Adaptor2、Core设计核酸序列如下:Adaptor1:5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3'Adaptor2:5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3'Core:5’-P-CTGTCTCTTATACACATCT-3’；按照下表，配制转座反应体系：组分体积转座缓冲液5μL转座酶复合物5μL步骤1.2.1的核酸(磁珠)---ddH本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速构建高通量测序文库的试剂，其特征在于包括核酸释放剂、反应终止液和磁珠活化剂；其中所述的核酸释放剂包括：5～500mM(pH7.0～9.0的Tris‑HCl、50～1000mM NaCl、0.1～10mM EDTA、质量/体积比0.01％～2％的SDS、质量/体积比0.04％～3％的LLS、0.01％～2％质量/体积比0.01～2％的甜菜碱和质量/体积比0.2‑1.5％的BSA，其中的体积百分比以无菌水体积为计算基准；所述的反应终止液包括：0.1～100mM EDTA、质量/体积比为0.1～5％的SDS和pH7.0～9.0的15～500mM Tris‑HCl；所述的磁珠活化剂包括100～5000mM NH4OH，25mM～500mM KCl，pH5.0‑9.0。

【技术特征摘要】
1.一种快速构建高通量测序文库的试剂，其特征在于包括核酸释放剂、反应终止液和磁珠活化剂；其中所述的核酸释放剂包括：5～500mM(pH7.0～9.0的Tris-HCl、50～1000mMNaCl、0.1～10mMEDTA、质量/体积比0.01％～2％的SDS、质量/体积比0.04％～3％的LLS、0.01％～2％质量/体积比0.01～2％的甜菜碱和质量/体积比0.2-1.5％的BSA，其中的体积百分比以无菌水体积为计算基准；所述的反应终止液包括：0.1～100mMEDTA、质量/体积比为0.1～5％的SDS和pH7.0～9.0的15～500mMTris-HCl；所述的磁珠活化剂包括100～5000mMNH4OH，25mM～500mMKCl，pH5.0-9.0。2.一种快速高通量测序文库构建的方法，其特征在于按照以下步骤进行：(1)样本核酸释放，使用核酸释放剂对样本进行处理，获得文库构建的模板；(2)在步骤(1)后直接加入核酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆利，沈欢，徐根明，潘艺，赵谦，
申请(专利权)人：湖南大地同年生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43