人乳头瘤病毒亚型L1基因的重组质粒构建方法技术

本发明专利技术公开了人乳头瘤病毒亚型L1基因的重组质粒构建方法，解决了目前由于缺乏各种亚型的L1阳性对照核酸标准样品，易出现干扰性质的HPV检测结果的问题，其技术方案要点是：NCBI数据库查找HPV不同亚型L1区的基因序列，采用网站上BLAST功能对其进行生物信息学分析，选定GP5

Construction of recombinant plasmid for human papillomavirus subtype L1 gene

The invention discloses a recombinant plasmid of human papilloma virus subtype L1 gene construction method, to solve the current due to the lack of standard positive control samples of L1 nucleic acid of various subtypes, prone to interference detection results of HPV nature of the problem, the technical proposal is that: NCBI gene sequence databases for different subtypes of HPV L1 region. The website BLAST function on the bioinformatics analysis of selected GP5

【技术实现步骤摘要】
人乳头瘤病毒亚型L1基因的重组质粒构建方法
本专利技术涉及基因工程
，特别涉及人乳头瘤病毒亚型L1基因的重组质粒构建方法。
技术介绍
人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)，属于乳多空病毒科的乳头瘤病毒属，是一种小分子的、无被膜包被的病毒。HPV基因组为环状双链DNA，基因组长约8000碱基对(bp)。根据功能可以把HPV基因组分为3个功能区：(1)早期转录区：又被称为E区，由4500个碱基对组成，分别编码为E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8这8个早期类蛋白，其中E1的功能与HPV的DNA的复制密切相关；E2是一类激活蛋白，E5与细胞的转化关系紧密，而早起的E6和E7是HPV表面的主要癌基因，因此早期专路器主要具有控制病毒的复制和转化的功能；(2)晚期转录区：又被称为L区，由2500个碱基对组成，主要编码2个衣壳蛋白L1和L2，L1和L2构成了HPV的衣壳，还和HPV的增殖有关联；其中L1是主要衣壳蛋白(约占衣壳蛋白的80％以上)；它既是一种糖蛋白，也是一种核蛋白，在其翻译加工完成后迅速定位于核中；在病毒颗粒形成过程中，L1具有自组装的功能；HPV的衣壳蛋白与其他病毒的衣壳蛋白相比，不同型的HPV的L1蛋白的氨基酸序列的同源性在60％以上；(3)长控制区：又称LCR区，由1000对碱基对组成，在E8和L1之间，包含复制起始区和复制转录控制元件。20世纪80年代，德国病毒学家HaraldzurHausen教授首次提出HPV病毒与宫颈癌发病相关的假说之后，经过20多年的科学研究，国际癌症研究所在1995年正式确认，高危型HPV持续感染是宫颈癌的主要病因。因此，检测宫颈细胞样本中人乳头瘤状病毒(HPV)的存在与其具体的基因型，可以作为宫颈癌预防及治疗的一种普遍早期诊断方法。依照WHO国际癌症研究机构(IARC)的研究成果，HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73等15种基因型在2005年的专题讨论会议上被正式认定为高危型。通过分子水平的检测可辅助子宫颈细胞学检查，能够筛查是否有高危型HPV感染。基于HPV核酸检测的分子生物学技术主要包括：第二代杂交捕获法(HC2)、酶切信号放大法、PCR-荧光探针法、转录介导的核酸扩增技术以及PCR-杂交法等。现有的HPV核酸检测的分子生物学技术大多针对HPV病毒的基因组中的L1保守区，但目前由于缺乏各种亚型的L1阳性对照核酸标准样品，易出现干扰性质的HPV检测结果(假阴性或假阳性)，假阴性结果可能导致宫颈癌诊断和治疗不及时，假阳性结果可能导致不必要的频繁筛查和侵袭性处置，将会引起潜在的公共卫生风险。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供人乳头瘤病毒亚型L1基因的重组质粒构建方法，通过重组质粒的构建提供了阳性参考对照样本，免了由于缺乏各种亚型的L1阳性对照核酸标准样品造成的检测结果出现假阴性或假阳性。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种人乳头瘤病毒亚型L1基因的重组质粒构建方法，所述方法包括如下步骤：Step.1针对NCBI数据库筛选的HPV病毒亚型的基因序列使用NCB1网站上的BLAST功能进行同源性和差异性的生物信息学序列分析，并通过PrimerPremier5.0针对HPV病毒亚型设计特异性引物；Step.2选取GP5+/6+引物组所在区域为中心，上下各延伸150～300bp作为构建重组质粒标准样品的目标区域，对HPV病毒亚型分别进行病毒DNA的提取，并对应的构建重组质粒；Step.3使用对应的重组质粒以及对应的特异性引物在10×Buffer、2.5μMdNTPs、25μMMgCl2、10μMPrimerF、10μMPrimerR、SDW、DNA、Taq(5U/μL)的混合体系中进行PCR扩增后，经洗脱得到PCR纯化后的重组质粒；Step.4将纯化后的重组质粒与pMD19-T载体连接后，将连接后的重组质粒导入感受态细胞中进行转化，将转化后的感受态细胞接种到固体培养基中，培养12～16h，得到若干菌落；Step.5选取培养基上的单菌落分别置于离心管中并加入液体培养基，混合形成菌液，进行离心、培养后，使用特异型引物与通用型引物分别对同一管离心管内的菌液进行PCR检测。通过采用上述技术方案，利用NCBI数据库的BLAST检索程序进行同源性和差异性的生物信息学序列分析，BLAST系统的运算机制不同于全序列比较，该系统的设计要注重平衡运算速度和增加系统非同源序列的敏感性，注重通过序列片段的某些区域来测定共有的相似序列片段的序列之间的关系，所以，不仅仅是一个通过序列排队比较测定序列的同源性简单工具，而且也是通过序列片段的相似性来对序列的结构和功能进行比较的工具，能够精确的进行同源性和差异性的对比，增加了比较的敏感性。在PCR扩增体系中，10×Buffer起到催化效果，2.5μMdNTPs为合成DNA的原料，25μMMgCl2的Mg2+能够使PCR扩增产物带型基本一致；10μMPrimerF为上游引物；10μMPrimerR为下游引物；SDW为灭菌去离子水，作为溶剂，经过灭菌后可以避免杂菌污染；DNA作为扩增样品、Taq(5U/μL)是Mg2+依赖性酶，对Mg2+的浓度十分敏感，优化Mg2+的浓度，能够促进Taq的酶活性。pMDTM19-TVector是一种高效克隆PCR产物的专用载体，由pUC19载体改建而成，在pUC19载体的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用EcoRV进行酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”而成；大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率；同时，由于本载体以pUC19载体为基础构建而成，所以它具有同pUC19载体相同的功能。经重组质粒转化为感受态细胞，筛选阳性克隆，并进行测序鉴定后，能够确保重组基因插入的正确性，在构建过程中，在靶基因的上下游用不同的内切酶切开形成黏末端，避免了插入错误，有利于阳性克隆的筛选，通过该方法，制得的各种HPV病毒亚型的L1阳性对照核酸标准样品，能够作为阳性对照样本，避免出现干扰性质的HPV检测结果。作为优选，根据NCBI数据库筛选的25个HPV病毒亚型为：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV81、HPV83。通过采用上述技术方案，上述25个HPV病毒亚型包含了既包含了高危型HPV病毒如16、58亚型，又包含了低危型的HPV病毒如11、6亚型，具有代表性。作为优选，选取GP5+/6+引物组所处的区域作为PCR检测的靶基因区域。通过采用上述技术方案，GP5+/6+具有相对较高的特异度和敏感度，GP5+/6+在PCR产物的电泳中产物的特异度好，杂带少，虽然GP6+引物的3′端仍然存在3个碱基的保守序列，但如果向外延伸，将会使两条引物的Tm值相差本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人乳头瘤病毒亚型L1基因的重组质粒构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：Step.1针对NCBI数据库筛选的HPV病毒亚型的基因序列使用NCB1网站上的BLAST功能进行同源性和差异性的生物信息学序列分析，并通过Primer Premier 5.0针对HPV病毒亚型设计特异性引物；Step.2选取GP5

【技术特征摘要】
1.一种人乳头瘤病毒亚型L1基因的重组质粒构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：Step.1针对NCBI数据库筛选的HPV病毒亚型的基因序列使用NCB1网站上的BLAST功能进行同源性和差异性的生物信息学序列分析，并通过PrimerPremier5.0针对HPV病毒亚型设计特异性引物；Step.2选取GP5+/6+引物组所在区域为中心，上下各延伸150~300bp作为构建重组质粒标准样品的目标区域，对HPV病毒亚型分别进行病毒DNA的提取，并对应的构建重组质粒；Step.3使用对应的重组质粒以及对应的特异性引物在10×Buffer、2.5μMdNTPs、25μMMgCl2、10μMPrimerF、10μMPrimerR、SDW、DNA、Taq(5U/μL)的混合体系中进行PCR扩增后，经洗脱得到PCR纯化后的重组质粒；Step.4将纯化后的重组质粒与pMD19-T载体连接后，将连接后的重组质粒导入感受态细胞中进行转化，将转化后的感受态细胞接种到固体培养基中，培养12~16h，得到若干菌落；Step.5选取培养基上的单菌落分别置于离心管中并加入液体培养基，混合形成菌液，进行离心、培养后，使用特异型引物与通用型引物分别对同一管离心管内的菌液进行PCR检测。2.根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒亚型L1基因的重组质粒构建方法，其特征在于，根据NCBI数据库筛选的HPV病毒亚型为：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV81、HPV83。3.根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒亚型L1基因的重组质粒构建方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张明洲，方结红，马骉，苏志春，
申请(专利权)人：温州美众医学检验所，
类型：发明
国别省市：浙江,33