一种马尾松cpSSR多态性引物及其松树近缘种的鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种马尾松cpSSR多态性引物及其松树近缘种的鉴定方法。本发明专利技术根据马尾松叶绿体基因组设计获得16对cpSSR引物，进一步从中筛选出差异较为稳定、多态性好的7对引物，并利用它们成功构建了8种松树近缘种的指纹图谱及系统进化树。本发明专利技术基于7对cpSSR引物，进行一次PCR扩增反应，并利用毛细管电泳技术对PCR产物进行分析，可准确鉴定8种松树近缘种树，具有高效、准确、方便、不易受环境影响的特点。本发明专利技术所述的多态性引物及其鉴定方法能够反映8种松树细胞质基因组的遗传信息，可用于8种松树近缘种的鉴定以及亲缘关系鉴定等研究。

A method for identification of Pinus massoniana cpSSR polymorphic primers and their Pinus pines

The invention discloses a method for identifying the cpSSR polymorphic primers of Pinus massoniana and the identification of the near marginal species of pine trees. According to the design of Pinus massoniana chloroplast genome, 16 pairs of cpSSR primers were obtained, and 7 pairs of primers with relatively stable and good polymorphism were selected from them. The fingerprints and phylogenetic trees of 8 species of pine related species were successfully constructed by using these primers. The invention is based on 7 pairs of cpSSR primers, one PCR amplification reaction, and capillary electrophoresis analysis of PCR products. It can accurately identify 8 kinds of pine related species. It has the characteristics of high efficiency, accuracy, convenience, and is not easy to be affected by the environment. The polymorphic primers and their identification methods can reflect the genetic information of 8 kinds of pine cytoplasm genome, and can be used for the identification of 8 kinds of pine related species and the identification of their relatives.

【技术实现步骤摘要】
一种马尾松cpSSR多态性引物及其松树近缘种的鉴定方法
本专利技术属于林木分子生物学
，特别涉及马尾松叶绿体微卫星分子标记(cpSSR)的多态性引物及其在8个松树近缘种鉴定中的应用。
技术介绍
松科(Pinaceae)松属(Pinus)植物是裸子植物中的重要类群，是世界上分布最广且最具有经济价值的树种之一。在中国，松属植物种类繁多，约有22种，分布范围广泛，在中国的林业生产和生态绿化中发挥着极为重要的作用。此外，中国先后从国外引进了一些重要的松属用材树种，包括火炬松(P.taeda)、湿地松(P.elliottii)、加勒比松(P.caribaea)等等。这些丰富的资源为我国松树遗传育种研究的开展提供了重要的物质基础。对松树种质资源的准确区分与鉴定是进行良种选育和遗传改良的基础。在传统的松树种质资源鉴定的过程中，均采用松树的细胞核DNA的SSR(SimpleSequenceRepeat，简单重复序列)分子标记法鉴定不同松树树种之间的在分子水平上的差异。SSR又叫微卫星DNA，指的是基因组中由1-6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广发分布于基因组的不同位置。研究表明，微卫星在真核生物的基因组中的含量非常丰富，而且常常是随机分布于核DNA中。毛细管电泳(capillaryelectrophoresis，CE)又称高效毛细管电泳(highperformancecapillaryelectrophoresis，HPCE)是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动的新型液相分离技术。它可以满足生命科学领域大分子、小分子分离分析的要求。与传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法相比，具有分辨率高(分辨率高达2bp)操作简单、重复性好和易清洗、样品用量少、分析速度快等优点。在实现本专利技术的过程中，专利技术人发现现有技术至少存在以下问题：现有技术对松树种质资源区分和亲缘关系鉴定的方法仅针对于松树的细胞核DNA，由于植物细胞中除细胞核遗传外，还具有细胞质遗传，而现有技术中少有记载有针对松树细胞核DNA外的其他物质用于松树的种质资源区分以及亲缘关系鉴定，因此仅采用细胞核DNA鉴定方法并不全面。此外，传统的松树遗传分析技术中，用于检测PCR产物最常用的方法是聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。该方法要经过电泳、固定、银染、显色、冲洗等步骤，其技术难度较大，实验程序复杂，且在银染过程中要接触到硝酸银等有毒化学试剂，对实验人员安全有一定危害。该方法理论上虽然可以达到5bp的分离率，但实际操作中难以实现，且不能准确读出片段大小，只能人为粗略估计，对长度小于50bp的扩增片段也无法分析。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种马尾松cpSSR多态性引物，满足使用需求。本专利技术的另一目的是提供一种上述马尾松cpSSR多态性引物的松树近缘种鉴定方法。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：马尾松cpSSR多态性引物，包括7对引物，其引物序列如下表所示：利用所述的马尾松cpSSR多态性引物构建出的松树近缘种的指纹图谱。所述的指纹图谱，如下表所示：所述的马尾松cpSSR多态性引物在松树近缘种鉴定中的应用。所述的应用：所述的松树近缘种有8种，分别为马尾松、黄山松、云南松、油松、白皮松、华山松、湿地松、加勒比松。所述的应用，包括以下步骤：1)待测样品DNA提取；2)利用权利要求1所述的马尾松cpSSR多态性引物进行PCR；3)对PCR产物进行毛细管电泳，以毛细管电泳结果与权利要求2所述的指纹图谱进行对比，鉴定出结果。所述的应用，10μLPCR反应体系包括：10×PCRBuffer；0.25mMdNTP；2.5mMMgCl2；0.3mM马尾松cpSSR引物；0.5UTaqDNA聚合酶和50ngDNA模版。所述的应用，PCR扩增程序为：预变性94℃5min；25循环的94℃30s，退火30s，72℃40s；延伸72℃5min。有益效果：本专利技术实施例提供的技术方案带来的由于叶绿体是植物细胞质中特有的细胞器，故叶绿体基因组的序列变异有助于植物细胞质基因型的区分，针对马尾松叶绿体基因组上的DNA序列筛选出来的叶绿体微卫星分子标记，该叶绿体微卫星分子标记具有细胞核基因组微卫星分子标记的共显性、高度变异和多态性等特点，此外，松树的叶绿体为父性遗传，父性遗传使叶绿体的DNA具有单亲遗传模式、且不易发生重组的特点，使得叶绿体微卫星分子标记具有结构简单、多拷贝以及分子量小等特点，同时，叶绿体微卫星分子标记主要位于叶绿体基因组的非编码区，而叶绿体DNA的非编码区序列在种内或种群间也存在遗传变异，使得该松树叶绿体微卫星分子标记的多态性引物能够全面地反映松树的遗传信息，使得本专利技术提供的鉴定松树遗传多样性的方法能够准确、全面地反应松树的遗传多样性，同时，也能够使得专利技术提供的鉴定松树亲缘关系的方法能够更全面。加上毛细管电泳技术高分辨率的特性，使得利用叶绿体微卫星分子标记鉴定8种松树亲缘关系的方法更加准确可靠。附图说明图1是本专利技术依据7种引物做出的8种松树近缘种的系统进化树图；图2是依据PowerMarkerversion3.25数据处理格式做出的部分毛细管电泳数据汇总结果图。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本专利技术作进一步地详细描述。实施例1马尾松叶绿体微卫星分子标记多态性引物(cpSSR)的获得：过程如下：1)叶绿体微卫星分子标记的多态性引物筛选从GenBank公共数据库中(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载马尾松(P.massioniana)叶绿体基因组序列(MF564195)，利用MicroSAtellite(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.hrml)(ThielT,MichalekW,VarshneyRK,etal.ExploitingESTdatabasesforthedevelopmentandcharacterizationofgene-derivedSSR-markersinbarley(HordeumvulgareL.).[J].Theoretical&AppliedGenetics,2003,106(3):411-422.)对马尾松叶绿体基因组序列进行分析，筛选叶绿体微卫星分子序列。2)叶绿体分微卫星分子标记的引物设计基于上述所获得的叶绿体微卫星分子序列，利用引物设计软件Primer3(https://sourceforge.net/projects/primer3/)(KoressaarT,RemmM.EnhancementsandmodificationsofprimerdesignprogramPrimer3.[J].Bioinformatics,2007,23(10):1289-91)分析微卫星分子的侧翼序列并进行引物设计。主要参数设置为：引物长18-24bp，引物退火温度50-60℃,前后引物退火温度之差避免超过2℃；GC含量40％-60％；预期产物长100-400bp。避免错配、引物二聚体或发夹结构的出现。设计出16对马尾松cpSSR引物，并在这16对引物中筛选出本文档来自技高网...

【技术保护点】
马尾松cpSSR多态性引物，其特征在于：包括7对引物，其引物序列如下表所示：

【技术特征摘要】
1.马尾松cpSSR多态性引物，其特征在于：包括7对引物，其引物序列如下表所示：2.利用权利要求1所述的马尾松cpSSR多态性引物构建出的松树近缘种的指纹图谱。3.根据权利要求2所述的指纹图谱，其特征在于，如下表所示：4.权利要求1所述的马尾松cpSSR多态性引物在松树近缘种鉴定中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的松树近缘种有8种，分别为马尾松、黄山松、云南松、油松、白皮松、华山松、湿地松、加勒比松。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：1)待测样品DNA提取；2)利用权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐立安，荣浩，倪州献，胥猛，韩炘，祁铭，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32