使用工程化全细胞催化剂生产无热量甜味剂制造技术

本文公开了全细胞催化剂、制备所述全细胞催化剂的方法，及使用所述全细胞催化剂生成甜菊醇糖苷的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用工程化全细胞催化剂生产无热量甜味剂支持提交序列表的声明本文提供了序列表的纸质复印件和含有命名为“32559_63_1.txt”，大小为36,234字节(正如在MICROSOFTEXPLORER中所测量)的文件的序列表的计算机可读形式并且通过引用并入本文。该序列表由SEQIDNO:1-12组成。公开背景本公开总体上涉及天然甜味剂。更具体地，本公开涉及无热量甜味剂及合成无热量甜味剂的方法。甜菊醇糖苷是从甜叶菊(Steviarebaudiana)叶片分离的天然产物。甜菊醇糖苷广泛地用作高强度、低热量的甜味剂并且明显比蔗糖更甜。作为天然甜味剂，不同的甜菊醇葡糖苷具有不同的甜度和后味。甜菊醇糖苷的甜度明显高于蔗糖的甜度。例如，甜菊苷比蔗糖甜100-150倍，具有苦的后味。莱鲍迪苷C(RebaudiosideC)比蔗糖甜40-60倍。杜尔可苷A(DulcosideA)比蔗糖甜约30倍。天然存在的甜菊醇糖苷共有相同的基本甜菊醇结构，但是在C13和C19位置的碳水化合物残基(例如，葡萄糖、鼠李糖和木糖残基)的含量上不同。具有已知结构的甜菊醇糖苷包括，甜菊醇、甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F和杜尔可苷A(参见例如，表1)。其它甜菊醇糖苷为莱鲍迪苷M、莱鲍迪苷N和莱鲍迪苷O。表1.甜菊醇糖苷。按干重计，甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷C和杜尔可苷A分别占叶中甜菊醇糖苷总重量的9.1、3.8、0.6和0.3％，而其它甜菊醇糖苷以低得多的量存在。来自甜叶菊植株的提取物可商购，通常含有作为主要化合物的甜菊苷和莱鲍迪苷A。其它甜菊醇糖苷在甜叶菊提取物中作为微量组分存在。例如，商用制剂中莱鲍迪苷A的量可以在总甜菊醇糖苷含量的约20％至大于90％变化，而莱鲍迪苷B的量可为总甜菊醇糖苷的约1-2％，莱鲍迪苷C的量可为总甜菊醇糖苷的约7-15％，且莱鲍迪苷D的量可为总甜菊醇糖苷的约2％。大多数甜菊醇糖苷是使用尿苷5’-二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)作为糖部分的供体，通过通常由UDP-糖基转移酶(UGT)催化的甜菊醇的几个糖基化反应形成的，如图1A、图1B、图1C、图1D和图1E中所示。植物中的UGT构成了酶的非常不同的类，所述酶将葡萄糖残基从UDP-葡萄糖转移到甜菊醇。例如，甜菊苷的C-13-O-葡萄糖的C-3’的糖基化产生莱鲍迪苷A；且甜菊苷的19-O-葡萄糖的C-2’的糖基化产生莱鲍迪苷E。进一步地莱鲍迪苷A(在C-2’-19-O-葡萄糖处)或莱鲍迪苷E(在C-3’-13-O-葡萄糖处)的糖基化生成莱鲍迪苷D。莱鲍迪苷D(在C-3’-19-O-葡萄糖处)的糖基化生成莱鲍迪苷M。替代性甜味剂正受到越来越多的关注，因为意识到许多疾病与高糖食品和饮料的消耗相关。虽然人造甜味剂可用，但许多人造甜味剂如甘素(dulcin)、环己氨基磺酸钠和糖精由于对其安全性的考虑已被一些国家禁止或限制。因此，天然来源的无热量甜味剂变得越来越受欢迎。广泛使用甜叶菊甜味剂的主要障碍之一是其不良的口味属性。因此，需要开发替代性甜味剂及其生产方法以提供甜味潜能和风味性质的最佳组合。专利技术概述本公开总体上涉及天然甜味剂。更具体地，本公开涉及无热量甜味剂和合成无热量天然甜味剂的方法。全细胞催化剂。一方面，本公开涉及至少一种全细胞催化剂。在这个方面中，所述至少一种全细胞催化剂是包括至少一个编码至少一种酶的核苷酸序列的转化宿主细胞，所述至少一种酶包括但不限于尿苷二磷酸糖基转移酶(UDP-糖基转移酶)和蔗糖合成酶(SUS)。合适的尿苷二磷酸糖基转移酶的非限制性实例包括：UGT76G1、HV1、EUGT11及其任何组合。在这个方面中，转化宿主细胞可以是通过包括至少一个编码至少一种酶的核苷酸序列的至少一个表达盒转化的任何合适宿主细胞。合适的宿主细胞的非限制性实例包括细菌、酵母、丝状真菌、蓝细菌藻和植物细胞。一方面，选择所述至少一个表达盒以与宿主细胞类型相容，并且编码所述至少一种酶的所述至少一个核苷酸序列内的密码子可以使用已知方法进行密码子优化以便增强所述至少一种酶在选定的宿主细胞类型中的表达。合成甜菊醇糖苷的方法。另一方面，所述至少一种全细胞催化剂可用于合成如本文所述的至少一种甜菊醇糖苷的方法中。所述方法包括在包括底物的培养基中体外培养所述至少一种全细胞催化剂。不受任何特定理论的限制，由转化宿主细胞内的所述至少一个表达盒生成的所述至少一种酶酶促糖基化培养基内的底物以合成所需的至少一种甜菊醇糖苷。全细胞催化剂巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)菌株。另一方面，本公开涉及一种全细胞催化剂，其包括通过含至少一个核苷酸序列的至少一个表达盒转化的巴斯德毕赤酵母宿主细胞，所述至少一个核苷酸序列包括：编码融合蛋白的第一核苷酸序列，其包括编码毕赤酵母(Pichia)细胞壁蛋白的第一核苷酸片段，第一核苷酸片段插入编码UDP-糖基转移酶的第二核苷酸片段C端的框内；和编码蔗糖合成酶的第二核苷酸序列。转化巴斯德毕赤酵母细胞的所述至少一个核苷酸序列可表达以生成全细胞催化剂，其特征在于一定量展示在巴斯德毕赤酵母细胞的细胞表面上的UDP-糖基转移酶和一定量的细胞内蔗糖合成酶。转化巴斯德毕赤酵母一方面可包括所述至少一个核苷酸序列中的每一个的一个或多个拷贝。第一巴斯德毕赤酵母菌株(G/K4S2)包括：四个拷贝的含第一核苷酸序列的表达盒，第一核苷酸序列包括插入编码UDP-糖基转移酶(UGT76G1)的第二核苷酸片段C端的框内的毕赤酵母细胞壁蛋白(GCW61)；和两个拷贝的含编码蔗糖合成酶(mbSUS1)的第二核苷酸序列的表达盒。第二巴斯德毕赤酵母菌株(G/H5S2)包括：五个拷贝的含第一核苷酸序列的表达盒，第一核苷酸序列包括插入编码UDP-糖基转移酶(HV1)的第二核苷酸片段C端的框内的毕赤酵母细胞壁蛋白(GCW61)；和两个拷贝的含编码蔗糖合成酶(mbSUS1)的第二核苷酸序列的表达盒。由甜菊苷生成莱鲍迪苷A的方法。另一方面，本公开涉及一种由甜菊苷合成莱鲍迪苷A的方法。所述方法包括在包括甜菊苷底物的培养基中培养全细胞催化剂足够的时间以生成莱鲍迪苷A，其中葡萄糖与甜菊苷共价偶联以生成莱鲍迪苷A。全细胞催化剂是表达一定量的UDP-糖基转移酶(UGT76G1)和一定量的蔗糖合成酶(mbSUS1)的转化宿主细胞。一方面，全细胞催化剂可以是巴斯德毕赤酵母的G/K4S2菌株并且培养基还可包括：磷酸钾缓冲液、MgCl2、蔗糖、UDP-葡萄糖、UDP及其任何组合。由莱鲍迪苷D生成莱鲍迪苷M的方法。一方面，本公开涉及一种由莱鲍迪苷D合成莱鲍迪苷M的方法。所述方法包括用包括莱鲍迪苷D底物的培养基培养全细胞催化剂足够的时间以生成莱鲍迪苷M，其中葡萄糖与莱鲍迪苷D共价偶联以生成莱鲍迪苷M。全细胞催化剂是表达一定量的UDP-糖基转移酶(UGT76G1)和一定量的蔗糖合成酶(mbSUS1)的转化宿主细胞。一方面，全细胞催化剂可以是巴斯德毕赤酵母的G/K4S2菌株并且培养基还可包括：磷酸钾缓冲液、MgCl2、蔗糖、UDP-葡萄糖、UDP及其任何组合。由莱鲍迪苷E生成莱鲍迪苷D的方法。另一方面，本公开涉及一种由莱鲍迪苷E合成莱鲍迪苷D的方法。所述方法包括用包括莱鲍迪苷E底物的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于生成甜菊醇糖苷的全细胞催化剂，所述全细胞催化剂包含含至少一个编码至少一种酶的核苷酸序列的转化宿主细胞，所述至少一种酶包含尿苷二磷酸糖基转移酶(UDP‑糖基转移酶)和蔗糖合成酶(SUS)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.14 US 62/147,1601.一种用于生成甜菊醇糖苷的全细胞催化剂，所述全细胞催化剂包含含至少一个编码至少一种酶的核苷酸序列的转化宿主细胞，所述至少一种酶包含尿苷二磷酸糖基转移酶(UDP-糖基转移酶)和蔗糖合成酶(SUS)。2.根据权利要求1所述的全细胞催化剂，其中所述全细胞催化剂还包含多种展示在所述转化宿主细胞的细胞表面上的所述尿苷二磷酸糖基转移酶(UDP-糖基转移酶)和一定量的细胞内蔗糖合成酶(SUS)。3.根据权利要求2所述的全细胞催化剂，其中所述宿主细胞包括细菌细胞、酵母细胞、丝状真菌细胞、蓝细菌藻细胞或植物细胞。4.根据权利要求3所述的全细胞催化剂，其中所述宿主细胞是选自以下的酵母细胞：Arxula属、假丝酵母属、德巴利酵母属、汉森酵母属、克鲁维酵母属、毛霉菌属、管囊酵母属、法夫酵母属、毕赤酵母属、红冬孢酵母属、酵母属、复膜孢酵母属、许旺酵母属、丝孢酵母属、球拟酵母属、耶氏酵母属和接合酵母属。5.根据权利要求4所述的全细胞催化剂，其中所述宿主细胞是选自以下的酵母细胞：Arxulaadeninivorans、白假丝酵母、博伊丁假丝酵母、无名假丝酵母、麦芽糖假丝酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母、休哈塔假丝酵母、多形汉森酵母、马克斯克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、嗜单宁管囊酵母、红法夫酵母、季也蒙毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母、圆红冬孢酵母、酿酒酵母、酿酒酵母糖化变种、布拉酵母、梨形酵母、贝酵母、扣囊复膜孢酵母、卡斯坦氏许旺酵母、西方许旺酵母、皮状丝孢酵母、解脂耶氏酵母和鲁氏接合酵母。6.根据权利要求1所述的全细胞催化剂，其中使用包含所述至少一个核苷酸序列的至少一个表达盒转化所述宿主细胞，其中将所述至少一个表达盒引入所述宿主细胞中以产生所述转化宿主细胞。7.根据权利要求1所述的全细胞催化剂，其中所述至少一个核苷酸序列还包含编码展示多肽的展示序列，所述展示多肽配置为使所述UDP-糖基转移酶附接于所述细胞表面。8.根据权利要求1所述的全细胞催化剂，其中所述UDP-糖基转移酶包括以下的至少一种：UGT76G1、HV1和EUGT11。9.根据权利要求1所述的全细胞催化剂，其中所述SUS包括以下的至少一种：源自阿拉伯芥的SUS或源自绿豆的SUS。10.根据权利要求9所述的全细胞催化剂，其中所述SUS包括以下的至少一种：拟南芥蔗糖合成酶1；拟南芥蔗糖合成酶3；绿豆蔗糖合成酶(mbSUS1)。11.根据权利要求1所述的全细胞催化剂，其中所述宿主细胞是巴斯德毕赤酵母细胞并且所述至少一个核苷酸序列编码选自UGT76G1(SEQIDNO:9)或HV1(SEQIDNO:7)的UDP-糖基转移酶，和包含mbSUS1(SEQIDNO:11)的SUS。12.根据权利要求11所述的全细胞催化剂，其中所述至少一个核苷酸序列编码选自UGT76G1-GCW61(SEQIDNO:3)或HV1-GCW61(SEQIDNO:1)的融合蛋白，所述UGT76G1-GCW61包含与巴斯德毕赤酵母细胞壁蛋白GCW61(SEQIDNO:5)融合的UGT76G1(SEQIDNO:9)，并且所述HV1-GCW61包含与巴斯德毕赤酵母细胞壁蛋白GCW61(SEQIDNO:5)融合的HV1(SEQIDNO:7)。13.根据权利要求12所述的全细胞催化剂，其中所述全细胞催化剂为G/H5S2细胞，其包括含五个拷贝的HV1-GCW61序列(SEQIDNO:2)和两个拷贝的mbSUS1序列(SEQIDNO:12)的转化巴斯德毕赤酵母宿主细胞。14.根据权利要求12所述的全细胞催化剂，其中所述全细胞催化剂为G/K4S2细胞，其包括含四个拷贝的UGT76G1-GCW61序列(SEQIDNO:4)和两个拷贝的mbSUS1序列(SEQIDNO:12)的转化巴斯德毕赤酵母宿主细胞。15.根据权利要求12所述的全细胞催化剂，其中所述全细胞催化剂为：G/H5S2细胞，其包括含五个拷贝的HV1-GCW61序列(SEQIDNO:2)和两个拷贝的mbSUS1序列(SEQIDNO:12)的转化巴斯德毕赤酵母宿主细胞；及G/K4S2细胞，其包括含四个拷贝的UGT76G1-GCW61序列(SEQIDNO:4)和两个拷贝的mbSUS1序列(SEQIDNO:12)的转化巴斯德毕赤酵母宿主细胞。16.一种通过使选自甜茶苷、莱鲍迪苷KA、甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E及其任何组合的底物糖基化来生成选自莱鲍迪苷KA、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷M及其任何组合的甜菊醇糖苷的方法，所述方法包括：在包含所述底物、蔗糖、UDP和/或UDP-葡萄糖的培养基中孵育全细胞催化剂合适的孵育期...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛国红，J·E·维克，SY·李，X·于，
申请(专利权)人：康纳根有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US