一种寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗制造技术

本发明专利技术提供了一种寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗，属于生物制品制备技术领域。本发明专利技术的联合灭活疫苗中含有0.5‑10ug/ml黄热病毒和0.5‑10ug/ml寨卡病毒。本发明专利技术还提供了寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗的制备方法，包括黄热病毒和寨卡病毒的接种、纯化和灭活步骤，其中黄热病毒接种MOI为0.01‑1PFU/ml，寨卡病毒接种MOI为0.001‑0.1CCID50/ml。本发明专利技术的疫苗能够同时免疫寨卡病毒和黄热病毒，避免了减毒疫苗导致的感染和过敏反应，具有良好的防控寨卡病毒和黄热病毒引起疾病的能力。

A Zika virus and yellow fever virus combined vaccine

The invention provides a Zika virus and yellow fever virus combined inactivated vaccine preparation, which belongs to the technical field of biological products. The invention of the combined inactivated vaccine containing 0.5 10ug/ml and 0.5 yellow fever virus 10ug/ml Zika virus. The invention also provides a method for preparing Zika virus and yellow fever virus combined with inactivated vaccine, including yellow fever virus and Zika virus inoculation, purification and inactivation steps, including yellow fever virus inoculation of MOI was 0.01 1PFU/ml, Zika virus inoculated MOI 0.001 0.1CCID50/ml. The invention of the vaccine to immune Zika virus and yellow fever virus, avoid attenuated vaccine induced infection and allergic reactions, has good prevention and control of Zika virus and yellow fever virus ability to cause disease.

【技术实现步骤摘要】
一种寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗
本专利技术属于生物制品制备
，具体地说，涉及一种含有寨卡病毒和黄热病毒的联合灭活疫苗。
技术介绍
目前全球广泛使用的黄热疫苗均为使用17D减毒株接种鸡胚组织制备的。我国自1953年开始生产黄热疫苗，至今已有50余年。多年临床应用表明，减毒黄热疫苗较安全有效，但也有因注射减毒黄热疫苗引起的严重副反应，主要是与黄热病毒有关的嗜内性疾病(yellowfeverassociatedviscerotropicdisease,YEL-AVD)和嗜神经性疾病(yellowfeverassociatedneurotropicdisease,YEL-AND)。YEL-AVD是一种引发肝脏和其它脏器急性爆发的感染，可导致60％的死亡率。而YEL-AND引发神经性疾患，可导致1-2％死亡率。从安全角度出发，本专利技术人利用细胞培养黄热病毒17D株，制备灭活疫苗，可杜绝YEL-AND和YEL-AVD的发生，并且避免了受试者因鸡胚导致的过敏反应。寨卡病毒自20世纪中期发现，主要在南美、非洲以及东南亚等热带地区流行，尚无疫苗保护。而2015年至2016年，在巴西由寨卡病毒引起的新生儿小头病多达上千例，引起巨大恐慌。随着我国经济水平的提高，人民群众出游前述地区商务及旅行的机会越来越多，亟需开发寨卡疫苗为国民健康保驾护航。目前还没有黄热病毒和寨卡病毒的联合灭活疫苗研制的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种安全、有效预防寨卡病毒和黄热病毒感染的二联灭活疫苗。本专利技术提供的一种寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗含有寨卡病毒和黄热病毒，且两者病毒均灭活。进一步，本专利技术的寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗含有0.5-10ug/ml黄热病毒和0.5-10ug/ml寨卡病毒。优选地，本专利技术的寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗含有1-8ug/ml黄热病毒和1-8ug/ml寨卡病毒。更优选地，本专利技术的寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗含有3-6ug/ml黄热病毒和3-6ug/ml寨卡病毒。本专利技术的联合疫苗还含有0.25％-1％谷氨酸钠、0.5％-1％甘露醇、0.5％-1％甘氨酸氧化三甲胺及0.2％-0.62％氢氧化铝，所述％均为质量体积比。最终pH调节到7.0-8.0。本专利技术实施例所用的黄热病毒为黄热病毒17D，用于培养黄热病毒17D的宿主细胞为Vero细胞。本专利技术提供一种寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗的制备方法，包括制备黄热病毒灭活液、制备寨卡病毒灭活液、将两种病毒灭活液按照蛋白含量进行稀释后混合，添加添加剂，使联合疫苗中含有0.5-10ug/ml黄热病毒和0.5-10ug/ml寨卡病毒。本专利技术的制备方法中，制备黄热病毒灭活液的方法包括以下步骤：(1)黄热病毒按照分种或混种的方式接种宿主细胞MOI为0.01-1PFU/ml，培养温度25-37℃，细胞病变60％-100％时收获病毒液；(2)黄热病毒收获液澄清、超滤后得到浓缩液，采用两步层析法纯化浓缩液，得到黄热病毒纯化液；(3)黄热病毒纯化液过滤，调节pH值7.5-8.5，灭活即得。其中，步骤(1)中步骤(1)中黄热病毒按照分种或混种的方式接种宿主细胞MOI为0.1-1PFU/ml；培养温度为33-37℃，细胞病变60％-85％时收获病毒液；步骤(3)中灭活是向黄热病毒纯化液中添加0.05-0.2％β丙内酯，于4℃下搅拌灭活20-26小时后，37℃水解2小时，得到黄热病毒灭活液。所述黄热病毒为黄热病毒17D，所述宿主细胞为Vero细胞。本专利技术的联合灭活疫苗的制备方法中，制备寨卡病毒灭活液的方法包括以下步骤：(1)寨卡病毒接种宿主细胞MOI为0.001-0.1CCID50/ml，培养温度25-35℃，待细胞病变25-35％收获80％的上清液，补加新鲜病毒培养液，继续培养至细胞病变45-55％，收获80％的上清液，补加新鲜病毒培养液，继续培养至细胞病变70-80％，收获80％的上清液，补加新鲜病毒培养液，继续培养至细胞病变90-100％，收获全部上清液；将前述4批上清液合并即为寨卡病毒的收获液；或待细胞病变45-55％，收获80％的上清液，补加新鲜病毒培养液，继续培养至细胞病变70-80％，收获80％的上清液，补加新鲜病毒培养液，继续培养至细胞病变90-100％，收获全部上清液；将前述3批上清液合并即为寨卡病毒的收获液；(2)寨卡病毒的收获液澄清、超滤，得到寨卡病毒浓缩液；采用两步层析法纯化浓缩液，得到寨卡病毒纯化液；(3)将寨卡病毒纯化液经0.22μm过滤，将pH调节至7.5-8.5之间，灭活即得。步骤(3)中灭活是向过滤后的寨卡病毒纯化液添加0.05-0.2％的β丙内酯在4℃下灭活20-26小时后水解，或向过滤后的寨卡病毒纯化液添加30-180ug/ml甲醛在22-28℃灭活96小时，去除甲醛，即为寨卡病毒灭活液。本专利技术的联合灭活疫苗的制备方法还包括将两种病毒灭活液按照蛋白含量进行稀释后混合，添加终浓度为0.2％-0.62％的氢氧化铝佐剂，0.5-1％谷氨酸、0.5-1％甘露醇、0.5-1％甘氨酸氧化三甲胺，调节pH到7.0-8.0。本专利技术的疫苗稳定性较好，理化性质稳定，两种免疫原无互相干扰，能够同时免疫寨卡病毒和黄热病毒，避免了减毒疫苗导致的感染和过敏反应，接种本专利技术的疫苗可以减少接种针次，简化免疫程序，操作上更加简洁，大大提高接种的覆盖率。同时可有效预防人及动物因上述病毒所致的疾病，覆盖更加广泛，免疫效果更好，具有良好的防控寨卡病毒和黄热病毒引起疾病的能力。本专利技术制备联合疫苗的方法简便，成本低，便于工业化大规模生产。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。如下所采纳的实施例使用了标准的技术，除非另有详细描述，为本领域技术人员众所周知且为常规技术。实施例是例证性的，但并不限制本专利技术。实施例1黄热病毒17D在Vero细胞挑斑与适应性培养为了使黄热病毒17D更好地在Vero细胞上适应生长，使用黄热病毒减毒活疫苗在Vero细胞上挑斑培养。经冻干的黄热病毒17D减毒活疫苗用注射水恢复原体积。根据已知疫苗的病毒滴度，用无血清199培养液系列稀释病毒。将每一个稀释度的病毒接种在已形成单层细胞的6孔板中，每孔接种0.4ml，在37℃，5％CO2培养箱中吸附1小时，然后加入无血清羧甲基纤维素工作液。培养一段时间后，在显微镜下选取蚀斑数少于3个的培养孔。用吸管吸取蚀斑，接种至单层的Vero细胞上培养。待到细胞病变为60-100％时，收获病毒培养液，离心去细胞碎片，得到蚀斑第一代病毒种子。向蚀斑第一代病毒种子加入一定量的病毒保护剂，检测病毒滴度，保存于-80℃冰箱。将蚀斑第一代病毒种子依照上法进行第二次蚀斑筛选。经过三次蚀斑筛选，挑选出适用于疫苗生产的黄热病毒株。将黄热病毒17D按照0.01PFU/cell接种至已经单层的Vero细胞表面。待细胞病变为75-85％时收获上清，分装冻存。记为P1代。将P1代按照0.01PFU/细胞接种至新鲜的单层Vero细胞表面。待细胞病变为65-90％时收获上清，分装冻存。记为P2代。如此进行黄热病毒在Vero细胞上的适应性培养，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗，其特征在于，含有寨卡病毒和黄热病毒，且两种病毒均灭活。

【技术特征摘要】
1.一种寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗，其特征在于，含有寨卡病毒和黄热病毒，且两种病毒均灭活。2.根据权利要求1所述的寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗，其特征在于，含有0.5-10ug/ml黄热病毒和0.5-10ug/ml寨卡病毒。3.根据权利要求1所述的寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗，其特征在于，含有1-8ug/ml黄热病毒和1-8ug/ml寨卡病毒。4.根据权利要求1所述的寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗，其特征在于，含有3-6ug/ml黄热病毒和3-6ug/ml寨卡病毒。5.根据权利要求1所述的寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗，其特征在于，所述黄热病毒为黄热病毒17D，用于培养黄热病毒17D的宿主细胞为Vero细胞。6.根据权利要求1-5任一所述的寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗，其特征在于，含有0.25％-1％谷氨酸钠、0.5％-1％甘露醇、0.5％-1％甘氨酸氧化三甲胺及0.2％-0.62％氢氧化铝，所述％均为质量体积比。7.根据权利要求1-5任一所述的寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗，其特征在于，疫苗pH为7.0-8.0。8.一种寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括制备黄热病毒灭活液、制备寨卡病毒灭活液、将两种病毒灭活液按照蛋白含量进行稀释后混合，添加添加剂，使联合疫苗中含有0.5-10ug/ml黄热病毒和0.5-10ug/ml寨卡病毒。9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：制备黄热病毒灭活液的方法包括以下步骤：(1)黄热病毒按照分种或混种的方式接种宿主细胞MOI为0.01-1PFU/ml，培养温度25-37℃，细胞病变60％-100％时收获病毒液；(2)黄热病毒收获液澄清、超滤后得到浓缩液，采用两步层析法纯化浓缩液，得到黄热病毒纯化液；(3)黄热病毒纯化液过滤，调节pH值7.5-8.5，灭活即得。10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中黄热病毒按照分种或混种的方式接种宿主细胞MOI为0.1-1PFU/ml。11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中培养温度为33-37℃，细胞病变60％-85％时收获病毒液。12.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中灭活是向黄热病毒纯化液中添加0.05-0.2％β丙内酯，于4℃下搅拌灭活20-26小时后，37...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴君兰，吕哲，王琳，李育蓉，郑翔，姜德玉，姚志东，高强，尹卫东，
申请(专利权)人：北京科兴生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11