PCV2 ORF2载体平台制造技术

本发明专利技术涉及免疫原载体，其中所述免疫原载体优选为包含多个经修饰的PCV2 ORF2蛋白的病毒样颗粒(VLP)。特别地，本发明专利技术属于允许区分被感染的个体和接种疫苗的个体的依从性标记物和标记物疫苗领域。特别地，它涉及包括亚单位抗原和DIVA(区分被感染的动物与接种疫苗的动物)系统的疫苗的依从性标记物，其使得能够区分被病原体感染的动物和用衍生自所述病原体的亚单位抗原处理的动物。

PCV2 ORF2 carrier platform

The present invention relates to immunogenic carrier, wherein the immunogenic carrier preferably virus like particles containing a plurality of modified PCV2 ORF2 protein (VLP). In particular, the present invention belongs to the field of adherence markers and marker vaccines that permit the distinction between infected individuals and vaccinated individuals. In particular, it relates to subunit antigen and DIVA (distinguish animal vaccinated with infected animal) compliance marker system of the vaccine, which makes it possible to distinguish the infected by pathogens and animal derived from the pathogen with subunit antigen processing animal.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】PCV2ORF2载体平台序列表本申请包含按照37C.F.R.1.821–1.825的序列表。本申请所附序列表在此全文引入作为参考。
本专利技术涉及免疫原载体，其中所述免疫原载体优选为包含多个经修饰的PCV2ORF2蛋白的病毒样颗粒(VLP)。特别地，本专利技术属于允许区分被感染的个体和接种疫苗的个体的依从性标记物和标记物疫苗领域。特别地，它涉及用于包括亚单位抗原的疫苗的依从性标记物，和DIVA(区分被感染的动物与接种疫苗的动物)系统，使得其能够区分被病原体感染的动物和用衍生自所述病原体的亚单位抗原处理的动物。
技术介绍
猪圆环病毒2型(PCV2)是小的(直径17-22nm)、二十面体的、无包膜的DNA病毒，其包含单链环状基因组。PCV2与猪圆环病毒1型(PCV-1)共享约80％序列相同性。但是，与一般无毒力的PCV1相反，感染PCV2的猪表现出通常称作断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的综合征。PMWS的临床特征是消瘦、皮肤苍白、瘦弱、呼吸窘迫、腹泻、黄疸(icterus)和黄疸病(jaundice)。在一些受感染的猪中，所有表现的组合会变得明显，而其他猪仅具有这些临床表现中的一种或两种。在尸检中，微观和宏观病变也出现在多个组织和器官上，其中淋巴器官是最常见的病变部位。已观察到PCV2核酸或抗原的量与微观淋巴病变的严重程度之间的高相关性。感染PCV2的猪的死亡率可以达到80％。除了PMWS，PCV2与几种其他感染有关，包括伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)、格拉塞氏病(Glasser’sdisease)、链球菌性脑膜炎、沙门氏菌病、断奶后大肠杆菌病、营养性肝功能障碍和化脓性支气管肺炎。目前，已知有3种亚型的PCV2(PCV2a、PCV2b和PCV2c)，它们根据PCV2基因型的统一命名进行分类(Segales,J.等人，2008,PCV-2genotypedefinitionandnomenclature,VetRec162:867-8)。已提出另外两种亚型(PCV2d和PCV2e)(Wang等人VirusRes.2009145(1):151-6)，但是，后来证实它们属于PCV2a和PCV2b簇(Cortey等人，VetMicrobiol.2011149(3-4):522-32011)。根据PCV2基因型的这种统一命名，orf2基因用来进行pcv-2的基因型分型，其中所述基因型分型是基于所比较的两个序列不同的核苷酸位点的比例(p距离)。这个值通过核苷酸差异的数量除以所比较的核苷酸的总数获得(Kumar等人2001Bioinformatics17,1244-1245)，随后，p距离/频率直方图的构建使得能够确定可能截断值以区分不同的基因型(Rogers和Harpending,1992MolecularBiologyandEvolution9,552-569；Biagini等人，1999JournalofGeneralVirology80,419-424)。利用这种方法，当ORF2PCV-2序列之间的遗传距离为0·035时，将它们分配至不同基因型。WO2011116094A2公开了嵌合猪圆环病毒感染性DNA克隆和具有PCV2的PCV2b亚型的活减毒嵌合病毒，以及整合到非致病性PCV1病毒基因组内的PCV2b亚型的衣壳基因，其中减毒的嵌合病毒可以用作活疫苗，以及灭活的(被杀死的)疫苗。疫苗接种是管理畜群健康的重要工具，特别是在其中饲养许多食用动物的高密度限制环境中。当推测接种疫苗的动物中出现疾病暴发时，产生关于疫苗是否未能保护动物还是疫苗是否被适当递送的问题，其中关于疫苗适当递送的后面一种可能性称为疫苗依从性。因此，生产者高度期望使用依从性标记物用于确定动物是否已被适当地接种疫苗。WO2009/058835A1描述了例如纯化的木聚糖酶的使用，所述纯化的木聚糖酶作为依从性标记物加入猪流感疫苗中。用于控制病毒暴发和感染的程序中使用的疫苗必须具有有效的系统，以监测群体内病毒感染的持续存在。然而，疫苗接种使通过例如血清学手段针对感染传播的大规模监视变得复杂化，因为接种疫苗的个体和暴露的个体两者产生对于病毒特异性的抗体。病毒的感染性强毒野生株与病毒疫苗之间的抗原相似性通常阻碍受感染的对象和接种疫苗的对象之间的区别，因为疫苗接种导致受感染的个体和接种疫苗的个体之间无法区分的抗体的出现和持续。DIVA(区分受感染的动物和接种疫苗的动物)疫苗接种策略的全球兴趣日益增加。例如，关于禽流感毒株H5N1HPAI的联合WHO/FAO/OIE会议已建议使用DIVA实践所有疫苗接种，因此可以监测感染传播。然而，目前的DIVA方法难以扩大，并且常常具有区分疫苗接种与由其他循环病毒株的感染的问题。目前的监测方法包括接种疫苗的动物的加上物理标签、哨兵动物的使用和病毒学测试。然而，由于后勤和经济原因，目前的这些方法具有许多局限性。接种疫苗的动物的加上物理标签涉及通过物理手段(例如耳标签、腿带或翼标签)对接种疫苗的个体的耗时个体鉴定。另外，未接种疫苗的哨兵动物的使用在后勤和经济上是困难的，并且还存在如果哨兵变得被病毒感染，例如家禽被H5N1病毒感染的风险，则传播给人类的风险增加。经由活病毒的筛选和检测或RT-PCR监测测试对个体的病毒学检测是非常昂贵和大量基础设施建设的过程，所述过程不适合于亚单位疫苗，并且仅提供与个体的当前状态相关的信息，并且不允许分析该个体的感染和/或疫苗接种史。考虑到所述局限性，允许血清学区别接种疫苗的动物和受感染的动物的标记物疫苗的使用是高度优选的，其中这种标记物疫苗可以制备为阴性或阳性标记物疫苗。通过使用病原体的抗原部分或通过从病原体中去除抗原(其在受感染的动物中引发特异性抗体)来制备阴性标记物疫苗。阴性标记物疫苗通常是亚单位疫苗或减毒活疫苗，其含有缺乏免疫原性抗原的遗传工程菌株。阴性标记物疫苗的实例是例如表达杆状病毒的经典猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白作为用于针对经典猪瘟疫苗接种的亚单位抗原的使用，其中接种疫苗的猪的血清中对于CSFV的其他抗原(例如ERNS蛋白或NS3蛋白)特异性的抗体检测显示CSFV感染。阳性标记物疫苗含有另外的抗原，其在接种疫苗的个体中而不是受感染的个体中诱导特异性抗体。在WO2007/053899A1中描述了阳性标记物疫苗方法的实例，其中灭活的H6N2禽流感(A1)病毒和破伤风毒素(这两者分开产生)在一次注射中组合用于给鸟接种疫苗，并且随后在得自所述鸟的血清中检测到对于破伤风毒素特异性的抗体作为显示鸟接种疫苗的标记物。然而，疫苗抗原和标记物抗原两者的分开生产相对昂贵。鉴于上文，需要可用作廉价生产阳性标记物疫苗和有效依从性标记物的平台的简单载体系统，并且另外，允许动物针对PCV2以及视情况而定的至少一种进一步的病原体的强免疫。附图说明以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括以进一步证实本专利技术的某些方面。通过参考与本文呈现的具体实施方案的详细描述组合的这些附图中的一个或多个，可以更好地理解本专利技术图1.通过与PCV2bORF2的大小比较，在染色的蛋白质凝胶中检测PCV2bORF2-c-myc条带。泳道1，Baculo/PCV2bORF2c-myc颗粒；泳道2：纯化的PCV2bORF2V本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种选自以下(a)、(b)和(c)的多肽：a.PCV2ORF2蛋白，其特征在于BC环中的至少一个氨基酸残基被目的氨基酸序列替代；b.PCV2ORF2蛋白，其特征在于将目的氨基酸序列插入BC环内；c.(a)和(b)的组合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.30 US 62/140,2841.一种选自以下(a)、(b)和(c)的多肽：a.PCV2ORF2蛋白，其特征在于BC环中的至少一个氨基酸残基被目的氨基酸序列替代；b.PCV2ORF2蛋白，其特征在于将目的氨基酸序列插入BC环内；c.(a)和(b)的组合。2.权利要求1的多肽，其中所述BC环是所述氨基酸位置58至66的区域，并且其中所述氨基酸位置的编号参考野生型PCV2ORF2蛋白的氨基酸序列。3.权利要求1的多肽，其中所述目的氨基酸序列是包含至少两个氨基酸残基或优选至少八个氨基酸残基的氨基酸序列、或者由至少两个氨基酸残基或优选至少八个氨基酸残基组成的氨基酸序列。4.权利要求1的多肽，其中所述目的氨基酸序列包含异源氨基酸序列或由异源氨基酸序列组成。5.权利要求1的多肽，其中所述目的氨基酸序列选自目的表位、生物应答调节子、生长因子、识别序列、融合蛋白，并且其中所述目的表位优选是来自抗原或兽医病原体或毒素的目的表位，并且其中所述目的表位是由PRRS病毒的orf5基因编码的肽，并且其中由PRRS病毒的orf5基因编码的所述肽优选包含SEQIDNO:6的氨基酸序列或由SEQIDNO:6的氨基酸序列组成，或者优选包含SEQIDNO:6中所示序列的至少8个连续氨基酸残基或由SEQIDNO:6中所示序列的至少8个连续氨基酸残基组成。6.权利要求1的多肽，其中所述目的氨基酸序列包含目的表位或由目的表位组成，并且其中所述目的表位优选是包含8至25个氨基酸残基或由8至25个氨基酸残基组成的氨基酸序列。7.权利要求1的多肽，其中在(a)中，所述氨基酸位置58至64的区域中的至少一个氨基酸残基被目的氨基酸序列替代，并且其中所述氨基酸位置的编号参考野生型PCV2ORF2蛋白的氨基酸序列。8.权利要求1的多肽，其中在(a)中，所述BC环中的至少两个氨基酸残基被目的氨基酸序列替代。9.权利要求1的多肽，其中在(a)中，所述BC环中的两、三、四、五、六或七个氨基酸残基被目的氨基酸序列替代。10.权利要求1的多肽，其中在(a)中，-所述氨基酸位置58至63的六个氨基酸残基被目的氨基酸序列替代，其中所述氨基酸位置的编号参考野生型PCV2ORF2蛋白的氨基酸序列；和/或-所述目的氨基酸序列包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列由11个氨基酸残基组成，和/或-所述目的氨基酸序列包含SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的序列、或者由SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的序列组成。11.权利要求1的多肽，其中所述多肽是重组蛋白质，优选重组杆状病毒表达的蛋白质。12.权利要求1的多肽，其中所述PCV2ORF2蛋白是PCV2b亚型(PCV2b)ORF2蛋白或PCV2a亚型(PCV2a)ORF2蛋白，和/或其中所述PCV2ORF2蛋白包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的氨基酸序列具有至少90％的序列相同性。13.权利要求1的多肽，其中所述多肽包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少90％的序列相同性。14.权利要求2的多肽，其中所述野生型PCV2ORF2蛋白是SEQIDNO:2或SEQIDNO:3中所示的蛋白质。15.一种免疫原性组合物，其含有权利要求1的多肽。16.一种多核苷酸，其包含编码权利要求1的多肽的序列。17.一种质粒，优选表达载体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码权利要求1的多肽的序列。18.一种包含质粒，优选表达载体的细胞，所述质粒包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码权利要求1的多肽的序列。19.一种病毒样颗粒，其包含多个权利要求1的多肽。20.一种杆状病毒，其含有多核苷酸，所述多核苷酸包含编码权利要求1至14中任一项的多肽的序列。21.一种细胞，优选昆虫细胞，其包含杆状病毒，所述杆状病毒含有多核苷酸，所述多核苷酸包含编码权利要求1至14中任一项的多肽的序列。22.以下用于制备药物，优选疫苗的用途：-权利要求1至14中任一项的多肽，-权利要求15的免疫原性组合物，-权利要求16的多核苷酸，-权利要求19的病毒样颗粒，-权利要求20的杆状病毒，-权利要求17的质粒，和/或-权利要求18或21的细胞。23.权利要求1至14中任一项的多肽或权利要求15的免疫原性组合物，其用于治疗或预防PCV2感染，减少、预防或治疗由PCV2感染引起的临床体征，或者预防或治疗由PCV2感染引起的疾病的方法中。24.用于根据权利要求23使用的权利要求1至14中任一项的多肽或权利要求15的免疫原性组合物，其中感染PCV2是感染PCV2b亚型(PCV2b)和/或感染除2b亚型外的PCV2亚型。25.用于根据权利要求23或24使用的权利要求1至20中任一项的多肽或权利要求15的免疫原性组合物，其中所述感染PCV2是感染除2b亚型外的PCV2亚型。26.用于根据权利要求24使用的权利要求1至14中任一项的多肽或权利要求15的免疫原性组合物，其中所述感染PCV2是同时感染(i)PCV2b和(ii)除2b亚型外的PCV2亚型。27.用于根据权利要求24至26中任一项使用的权利要求1至14中任一项的多肽或权利要求15的免疫原性组合物，其中所述感染除2b亚型外的PCV2亚型是感染PCV2a亚型(PCV2a)和/或PCV2c亚型(PCV2c)。28.用于根据权利要求24至27中任一项使用的权利要求1至14中任一项的多肽或权利要求15的免疫原性组合物，其中所述感染除2b亚型外的PCV2亚型是感染PCV2a。29.用于根据权利要求23至28中任一项使用的权利要求1至14中任一项的多肽或权利要求15的免疫原性组合物，其中所述感染PCV2是同时感染(i)PCV2b和(ii)PCV2a。30.用于根据权利要求23至29中任一项使用的权利要求1至14中任一项的多肽或权利要求15的免疫原性组合物，其中所述感染PCV2b是感染包含多肽或包含多核苷酸的PCV2，所述多肽与SEQIDNO:2的序列至少94％或...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·A·赫尔南德斯，E·M·沃恩，
申请(专利权)人：勃林格殷格翰动物保健公司，
类型：发明
国别省市：美国,US