检测早期食管癌预后情况的LncRNA组合及含有该组合的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了检测早期食管癌预后情况的LncRNA组合及含有该组合的试剂盒，本发明专利技术利用荧光定量PCR鉴定食管癌病人样本(样本可以是组织/血浆血清等)及对应的癌旁组织/参考样本中一组LncRNA表达量的差异变化，及早准确评估食管癌复发或转移的风险。本发明专利技术的试剂盒可对早期食管癌转移潜能进行准确检测，从而能对术后食管癌患者转移或复发风险进行准确的预测和评估，对高风险患者进行重点监测和有效干预，减少食管癌的复发或转移，进一步改善患者预后。本发明专利技术采用一组预后不良相关的lncRNA组合，避免仅采用单一lncRNA作为肿瘤标志物试剂盒引起的敏感度和特异度较低而导致食管癌诊断的错诊率和漏诊率大大增加的缺陷。

LncRNA combination for detecting the prognosis of early esophageal cancer and the kit containing the combination

The invention discloses a detection of early esophageal cancer prognosis LncRNA combination and kits containing such combinations, the invention uses the sample fluorescence quantitative PCR in patients with esophageal cancer (identification of samples can be tissue / plasma serum) and paracancerous tissues / reference samples in a group of LncRNA the difference was the amount of change, early and accurate assess the risk of recurrence or metastasis of esophageal cancer. The kit of the invention can accurately detect the potential of metastasis of early esophageal cancer, which can predict and evaluate the postoperative patients with esophageal cancer metastasis or recurrence risk accurately, focus on monitoring and effective intervention for high risk patients, reduce the recurrence or metastasis of esophageal cancer, further improve the prognosis of patients. The invention adopts a set of lncRNA combination with poor prognosis, which avoids the defect that the sensitivity and specificity caused by single lncRNA as a tumor marker kit is low, which results in the increase of misdiagnosis rate and missed diagnosis rate of esophageal cancer.

【技术实现步骤摘要】
检测早期食管癌预后情况的LncRNA组合及含有该组合的试剂盒
本专利技术属于生物医药
，具体涉及检测早期食管癌预后情况的LncRNA组合及含有该组合的试剂盒。
技术介绍
食管癌是常见的消化道恶性肿瘤。主要有两种病理类型：食管鳞状细胞癌(ESCC)和食管腺癌(EAC)，在西方国家主要以腺癌为主，在我国95％以上以鳞癌为主，占据我国癌症死因第四位。ESCC发病是一个多因素、多基因、多步骤相互叠加的复杂过程，具有高度侵袭性，晚期ESCC治疗后的总体生存率仅15%～20%，而早期ESCC术后5年生存率可达到80%以上。早期ESCC临床症状不典型，多依赖内镜下组织活检明确诊断，但受内镜操作、病变组织范围小等因素影响，活检取材仍有可能难以抓取到足够的肿瘤组织明确病理类型，导致假阴性结果而漏诊，出现部分患者早期淋巴结转移和局部复发，显示出较差的预后。因此，有必要探寻更敏感的组织诊断标志物，与组织学检查一起，在早发现的基础上尽早干预，提高患者ESCC转移和复发的诊断率，减少不良预后。肿瘤异质性包括时间和空间的异质性：同一肿瘤的不同区域，同种肿瘤的不同患者以及同一患者的不同治疗阶段，肿瘤均存在不同的生物学特征。由于恶性肿瘤异质性存在，使肿瘤组织内部出现不同亚型的肿瘤细胞株，导致肿瘤在演进过程中的高度复杂性和多样性，其差异可使患者对化学药物敏感性或对放疗敏感性存在差异；此外也会使肿瘤的浸润和转移、生长速度、侵袭能力等表型方面存在差异。肿瘤异质性的存在往往给肿瘤的个体化诊断和治疗带来极大的困难。由于检测标记物在肿瘤中异质性表达，目前大多数研究专注于单因素研究模式，仅探索一个或某几个基因与预后的相关性，不能全面地反映早期食管鳞癌准确的分子生物学特征，难以反映复杂转移过程，可能导致对病情进展了解不全面，这也是现今肿瘤精准治疗的不够理想的主要原因。肿瘤异质性的发生机制虽未完全阐明，但基因不稳定性所起的作用则无庸置疑。基因检测作为研究热点，其在肿瘤的发生、发展、转移及预后等判断方面具有一定的优势。目前，国内外关于ESCC发病机制的研究已在编码蛋白的基因mRNA、蛋白质以及非编码RNA领域取得了一系列成果。过去几十年，人们大多把注意力集中在编码蛋白的基因上，但编码蛋白的基因仅占基因组序列的2%，随着非编码RNA作为肿瘤标志物的出现，提示在肿瘤发生发展过程中，非编码RNA比受体、蛋白等出现得更早，而这对肿瘤的诊断尤为重要。近年来，随着分子生物学的发展，全基因组测序分析发现越来越多的长链非编码RNAs(LongnoncodingRNAs，lncRNAs)其致癌和抑癌作用在肿瘤的发生、发展、浸润转移以及对化疗的敏感性等多个过程中显示出的独特的生物学功能。lncRNA作为新型的肿瘤标志物用于肿瘤辅助诊断和预后判断指标已被广泛报道。事实上IncRNA的功能和它们的丰度之间可能存在一定的关联。lncRNA与食管鳞癌的发生发展有着密切的关系，可以在组织中稳定存在并被检测，符合临床标志物的要求。已有专利技术申请号CN201410118190.7、申请号CN201410118222.3和申请号CN201410118211.5只采用单个lncRNA作为诊断标记物，通过芯片和RT-qPCR验证了芯片结果，分析得知这几条lncRNA在食管鳞癌中表达上调，可作为预后指标和药物靶点，但并没有进一步说明与转移复发是否相关。随着对肿瘤异质性的深入研究，上述几种方案也已无法避免肿瘤异质性可能带来的误诊，影响对病程的判断。此外，申请号CN201611222527.4选取与食管鳞癌相关的32个蛋白编码基因标志物BCL-2，BIRC5(survivin)，STAT3等作为诊断标记物，据本专利作者先前文章综述：相关的32个基因标记物可能作为下游靶基因被部分lncRNA调控，且32个基因共同检测，检测过程相对繁琐，增加成本。由于IncRNA缺乏蛋白质的编码能力，因此更适合作为生物标志物。因此，在目前循证医学的时代背景下，本专利技术通过文献查阅，纳入全部出自中国的食管鳞癌临床研究报道，并对研究数据筛选验证出与食管鳞癌转移或不良预后相关的10条lncRNA，并建立区分早期食管鳞癌患者预后情况的诊断试剂盒，该试剂盒针对中国大陆患者的食管癌临床的研究数据，可以从转录水平全面提高对中国大陆患者食管鳞癌预后复发及转移预测的准确度。鉴于目前对食管鳞癌预后诊断及治疗不全面的现状。本专利技术在转录水平上检测生物标志物的表达水平，增加检测标记物，避免肿瘤异质性带来的误诊，对食管鳞癌预后诊断和治疗具有重要的临床指导意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述问题，提供一种增加检测标记物、提高检测准确度、减少误诊率的预测中国大陆早期食管癌预后情况的LncRNA组合及含有该组合的试剂盒。为实现上述目的，本专利技术提供了检测早期食管癌预后情况的LncRNA组合，包括LOC285194、AFAP1-AS1、UCA1、BANCR、MALAT1、ZEB1-AS1、HOTAIR、PCAT-1、NEAT1、CCAT2分子中的一条或多条。优选的，所述LncRNA组合包括AFAP1-AS1、UCA1、BANCR、MALAT1、ZEB1-AS1、HOTAIR、PCAT-1、NEAT1、CCAT2分子中的一条或多条表达上调，且表达差异高于参考范围，提示lncRNA在食管癌中呈高表达并与食管癌患者的预后呈负相关，高表达提示患者的生存期（OS）可能较短，是ESCC预后的危险因素，说明食管癌患者预后不良，可能复发或转移（见表3）。优选的，所述LncRNA组合包括LOC285194分子表达下调，且表达差异低于参考范围，提示lncRNA在食管癌中呈低表达并与食管癌患者的预后呈正相关，低表达提示患者的生存期可能较短，是ESCC预后的危险因素，说明食管癌患者预后不良，可能复发或转移（见表3）。检测食管癌预后情况的方法，包含以下步骤：1）测定离体样本中异常表达的LncRNA表达水平；2）比较被测定离体样本中与参考样本/配对的癌旁组织中的LncRNA分子是否存在差异表达，表达差异与食管癌患者预后复发或转移具有相关性。优选的，所述方法采用PCR扩增法。优选的，步骤2）中所述差异表达的主要分析对象包括患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、组织分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期及5年生存率等临床病理特征（见表2）。优选的，所述食管癌患者预后不良相关的lncRNA组合的参考范围见表5。优选的，所述的食管癌离体样本是食管癌组织样本或血液/血浆。用于检测早期食管癌预后情况的试剂盒，包含用于检测上述lncRNA组合在组织中或血液/血浆中的表达量高低的组分。优选的，所述组分包括RNA提取系统、逆转录试剂及PCR扩增试剂。优选的，所述RNA提取系统包括裂解液、RNA吸附柱和RNA漂洗液。优选的，所述逆转录试剂为5×iScriptReactionMix、iScriptReverseTranscriptase和DEPC水。优选的，所述试剂盒包括特异性扩增用于检测所述LOC285194、AFAP1-AS1、UCA1、BANCR、MALAT1、ZEB1-AS1、HOTAIR、PCAT-1、NEAT1、CCAT2的上下游引物序列以及内参GAPDH的本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测早期食管癌预后情况的LncRNA组合，其特征在于，所述LncRNA组合包括LOC285194、AFAP1‑AS1、UCA1、BANCR、MALAT1、ZEB1‑AS1、HOTAIR、PCAT‑1、NEAT1、CCAT2分子中的一条或多条。

【技术特征摘要】
1.检测早期食管癌预后情况的LncRNA组合，其特征在于，所述LncRNA组合包括LOC285194、AFAP1-AS1、UCA1、BANCR、MALAT1、ZEB1-AS1、HOTAIR、PCAT-1、NEAT1、CCAT2分子中的一条或多条。2.根据权利要求1所述检测早期食管癌预后情况的LncRNA组合，其特征在于，所述LncRNA组合包括AFAP1-AS1、UCA1、BANCR、MALAT1、ZEB1-AS1、HOTAIR、PCAT-1、NEAT1、CCAT2分子中的一条或多条。3.根据权利要求1所述检测早期食管癌预后情况的LncRNA组合，其特征在于，所述LncRNA组合包括LOC285194分子。4.用于检测早期食管癌预后情况的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测权利要求1所述lncRNA组合在组织中或血液/血浆中的表达量高低的组分。5.根据权利要求4所述用于检测早期食管癌预后情况的试剂盒，其特征在于，所述组分包括RNA提取系统、逆转录试剂及PCR扩增试剂。6.根据权利要求5所述用于检测早期食管癌预后情况的试剂盒，其特征在于，RNA提取系统包括裂解液...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐茜，阚云超，姚伦广，彭毅蕾，李丹丹，张冰，李娜，邱礽，姚路路，赵珂，李惠，
申请(专利权)人：南阳师范学院，
类型：发明
国别省市：河南,41