一种黄花白芨的鉴别方法技术

本发明专利技术公开了一种黄花白芨的鉴别方法，属于中药材鉴别技术领域，该方法包括以下步骤：挑选一批不同种类的黄花白芨和紫花白芨，采用CTAB方法分别抽提白芨个体基因组DNA，然后设计引物对白芨核糖体大亚基基因的D1‑D3区DNA序列进行扩增、克隆、测序和序列比对，确定待测SNP位点；进而针对待测SNP位点设计特异性的PCR扩增引物进行PCR扩增，验证SNP位点，得出标准数据；最后采用PCR扩增引物对待测样本的DNA进行扩增，并根据扩增产物在PCR扩增电泳图中目的条带的有无确定待测样本的SNP位点基因型，与标准数据相比较，从而判定待测样品是黄花白芨还是紫花白芨。

A method for the identification of Bletilla

The invention discloses a method for identification of Bletilla, which belongs to the technical field of identification of traditional Chinese medicine, the method comprises the following steps: selecting a number of different types of Bletilla striata and, using CTAB method were used to extract Bletilla individual genomic DNA, then amplified, cloned, sequenced and compared design primers to the large ribosomal subunit of Bletilla striata D1 D3 DNA gene sequence, determine the SNP site to be tested; then according to design specific measurement sites of PCR SNP were amplified by PCR primers, SNP validation sites, draw standard data; finally using PCR primers. The test sample DNA was amplified according to the amplified products of PCR amplification in gel electrophoresis objective there are no bands to determine SNP genotype samples, compared with the standard data, to determine whether the sample is still of Bletilla striata .

【技术实现步骤摘要】
一种黄花白芨的鉴别方法
本专利技术涉及中药材真假鉴别
，具体涉及一种黄花白芨的鉴别方法。
技术介绍
白芨是兰科，白芨属的一种。据《中国植物志》记载，全世界约有6种白芨，分布于亚洲的缅甸北部经我国至日本。我国产4种，分别为白芨、华北白芨、小白芨和黄花白芨，我国目前栽培的白芨品种有紫花白芨、黄花白芨和少量的小白芨。白芨以干燥块茎药用，具有收敛止血、清热利湿、消肿生肌之功效，临床上广泛用于治疗咳血、吐血、外伤出血、疮疡肿毒、肺结核咳血、溃疡病出血等病症，具有很大的商品开发潜力。近几年，随着对白芨药物成分的进一步分析，发现了它富含很多特殊的药用成分，包括白芨联菲、白芨联菲醇、白芨双菲醚、白芨二氢菲并吡喃酚、白芨菲螺醇，这些成分很难被其他物种替代，并且有很重要的利用价值。因此，白芨野生资源已远远不能满足市场需求，价格逐步攀升。尽管白芨属的几个种类均可作为中药材，但2015版《中国药典》中规定，中药材白芨为兰科植物白芨即紫花白芨的干燥块茎，而从干燥后的块茎很难区分是紫花白芨还是黄花白芨，加上黄花白芨块茎细胞组织相对疏松，折干率相对低。因此，开发能够鉴别黄花白芨与紫花白芨的鉴别方法对保障药材的质量至关重要，但目前尚未出现相关文献报道。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术提供了一种黄花白芨的鉴别方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的。一种黄花白芨的鉴别方法，包括以下步骤：a、挑选种植时间相同的黄花白芨和紫花白芨各3株，采用CTAB方法分别抽提个体基因组DNA；b、设计引物分别对3株紫花白芨DNA和3株黄花白芨DNA的核糖体大亚基基因的D1-D3区DNA序列进行扩增、克隆、测序和序列比对，当3株紫花白芨和3株黄花白芨都出现SNP位点时，确定该待测SNP位点；c、针对SNP位点设计特异性的PCR扩增引物，将PCR扩增引物中的正向引物或反向引物的3'末端对应待测SNP进行扩增，验证该SNP位点，得出SNP位点标准基因数据；d、采用PCR扩增引物对待测样本的DNA进行扩增，并根据扩增产物在PCR扩增电泳图中目的条带的有无确定待测样本SNP位点基因型，将此基因与SNP位点标准基因数据相比较，从而判定待测样品是黄花白芨还是紫花白芨。优选的，步骤(b)中，所述引物为DUAN5：5'-TAGTAACGGCGAGCGAAC-3'；DUNA6：5'-GGCATAGTTCACCATCTTTC-3'。优选的，步骤(b)中，所述扩增产物大小为760bp。优选的，步骤(b)中，所述SNP位点位于白芨核糖体大亚基基因的D1-D3区DNA序列扩增产物的637bp处和642bp处，其中黄花白芨在这2个位点碱基分别为C、G，紫花白芨为T、A。优选的，步骤(c)中，所述SNP位点验证方法为设计如下特异引物：DUAN5：5'-TAGTAACGGCGAGCGAAC-3'，JDHH：5'-TTATCAGCTTCCTTGCGCCG-3'；扩增引物中反向引物的3'末端对应第一个待测SNP，扩增产物大小为650bp。优选的，步骤(d)中，所述PCR扩增的条件为：预变性温度94℃，时间5min；变性温度94℃，时间1min；退火温度54℃，时间45s；延伸温度72℃，时间1min；按此条件循环30次，最后在72℃时延伸10min，4℃温度下冷藏保存。优选的，步骤(d)中，所述PCR扩增的体系为30μL体系，其中5×Taqbuffer6μL，dNTPs2.4μL，上下游引物各1μL，引物终浓度0.4μM；模板1μL，模板终浓度约60ng；Taq酶0.15μL，加ddH2O至30μL。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种黄花白芨的鉴别方法，致力于提供一种紫花白芨和黄花白芨鉴别用SNP位点标记手段，以及检测该位点基因型用的引物及检测方法。在最佳的退火温度和PCR反应条件下，显著提高PCR扩增引物与模板DNA链结合的特异性，使其严格按照正确的碱基互补配对原则进行扩增，进而通过电泳检测扩增产物的条带有无来判断碱基类型，实现待检测SNP位点的基因型分型，达到检测药材白芨品种的目的，为中药材黄花白芨和紫花白芨提供了一种全新的、科学的、有效的鉴别方法。附图说明图1是实施例1中PCR扩增电泳图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进一步作详细的说明。实施例1一种黄花白芨的鉴别方法，包括以下步骤：a、挑选年份相同、生长条件相同、植株大小相同的黄花白芨3株，紫花白芨3株，采用CTAB方法分别抽提个体基因组DNA；然后用扩增引物DUAN5：5'-TAGTAACGGCGAGCGAAC-3'，DUNA65'-GGCATAGTTCACCATCTTTC-3'进行PCR扩增，扩增产物大小为760bp；扩增条件为温度94℃时预变性5min，温度94℃时变性1min，温度58℃时退火45s，温度72℃时延伸1min，按此循环30次，最终在温度72℃时延伸10min，温度4℃下冷藏保存；PCR扩增初始反应体系为：30μL体系中含5×Taqbuffer6μL、dNTPs2.4μL、引物各1μL、引物终浓度0.4μM、模板1μL、模板终浓度约60ng、Taq酶0.15μL，补加ddH2O至30μL；b、将PCR扩增产物连接T载体进行克隆，然后进行测序和序列比对，检测结果表明在3株紫花白芨和3株黄花白芨核糖体大亚基基因的D1-D3区DNA序列637bp和642bp处均出现2个SNP位点，其中黄花白芨在这2个位点碱基分别为C、G，而紫花白芨为T、A；c、针对这2个SNP位点设计特异性引物，即DUAN5：5'-TAGTAACGGCGAGCGAAC-3'，JDHH：5'-TTATCAGCTTCCTTGCGCCCG-3'，进行基因型分型，斜体“C”，“G”为SNP位点；d、用引物DUAN5：5'-TAGTAACGGCGAGCGAAC-3'和JDHH：5'-TTATCAGCTTCCTTGCGCCCG-3'进行PCR扩增验证SNP位点；PCR扩增条件为：预变性温度94℃，时间5min；变性温度94℃，时间1min；退火温度54℃，时间45s；延伸温度72℃，时间1min；按此循环30次，最终在72℃时延伸10min，温度4℃下冷藏保存；PCR扩增体系为30μL体系中含5×Taqbuffer6μL、dNTPs2.4μL、上下游引物1μL、引物终浓度0.4μM、模板1μL、模板终浓度约60ng、Taq酶0.15μL、加ddH2O至30μL；PCR扩增电泳结果显示黄花白芨扩增出条带，而紫花白芨没有扩增出条带，从而验证黄花白芨SNP位点碱基对为C、G，而紫花白芨SNP位点碱基对为T、A，PCR扩增电泳结果图见图1；实施例2一种黄花白芨的鉴别方法，包括以下步骤：a、挑选种植时间相同的白芨个体60株，其中包括黄花白芨2株；b、采用CTAB方法分别抽提60株个体基因组DNA；c、采用扩增引物DUAN5：5'-TAGTAACGGCGAGCGAAC-3'和JDHH：5'-TTATCAGCTTCCTTGCGCCCG-3'进行PCR扩增；PCR扩增条件为：预变性温度94℃，时间5min；变性温度94℃，时间1min；退火温度54℃，时间45s；延伸温度72℃，时间1min；按此循环30次，最终在72℃时延伸10min，温度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黄花白芨的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：a、挑选种植时间相同的黄花白芨和紫花白芨各3株，采用CTAB方法分别抽提个体基因组DNA；b、设计引物分别对3株紫花白芨DNA和3株黄花白芨DNA的核糖体大亚基基因的D1‑D3区DNA序列进行扩增、克隆、测序和序列比对，当3株紫花白芨和3株黄花白芨都出现SNP位点时，确定该待测SNP位点；c、针对SNP位点设计特异性的PCR扩增引物，将PCR扩增引物中的正向引物或反向引物的3'末端对应待测SNP进行扩增，验证该SNP位点，得出SNP位点标准基因数据；d、采用PCR扩增引物对待测样本的DNA进行扩增，并根据扩增产物在PCR扩增电泳图中目的条带的有无确定待测样本SNP位点基因型，将此基因与标准基因数据相比较，从而判定待测样品是黄花白芨还是紫花白芨。

【技术特征摘要】
1.一种黄花白芨的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：a、挑选种植时间相同的黄花白芨和紫花白芨各3株，采用CTAB方法分别抽提个体基因组DNA；b、设计引物分别对3株紫花白芨DNA和3株黄花白芨DNA的核糖体大亚基基因的D1-D3区DNA序列进行扩增、克隆、测序和序列比对，当3株紫花白芨和3株黄花白芨都出现SNP位点时，确定该待测SNP位点；c、针对SNP位点设计特异性的PCR扩增引物，将PCR扩增引物中的正向引物或反向引物的3'末端对应待测SNP进行扩增，验证该SNP位点，得出SNP位点标准基因数据；d、采用PCR扩增引物对待测样本的DNA进行扩增，并根据扩增产物在PCR扩增电泳图中目的条带的有无确定待测样本SNP位点基因型，将此基因与标准基因数据相比较，从而判定待测样品是黄花白芨还是紫花白芨。2.根据权利要求1所述的一种黄花白芨的鉴别方法，其特征在于，步骤(b)中，所述引物为DUAN5：5'-TAGTAACGGCGAGCGAAC-3'；DUNA6：5'-GGCATAGTTCACCATCTTTC-3'。3.根据权利要求1所述的一种黄花白芨的鉴别方法，其特征在于，步骤(b)中，所述扩增产物大小为760bp。4.根据权利要求1所述的一种黄花白芨的鉴别方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘红美，张洁，刘显义，张婷婷，曾丽娜，
申请(专利权)人：贵州医科大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52