一种用于检测脆性X综合征的引物组及其试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测脆性X综合征的引物组及其试剂盒。所述试剂盒包含检测脆性X综合征的引物组，所述引物组包括用于检测CGG重复数的上游引物F和下游引物R，以及用于检测AGG插入信息的上游引物F和下游引物M；所述上游引物F的序列如SEQ ID NO：1所示，其5’端带FAM荧光；下游引物R的序列如SEQ ID NO：2所示；下游引物M的序列如SEQ ID NO：3所示。本发明专利技术的试剂盒可以检测样本是否为前突变携带或全突变携带，避免漏检，所述方法操作简单、方便快捷、成本低，而且具有较强的特异性和较高的灵敏度，具有较大的应用前景。

A primer group and its kit for the detection of fragile X syndrome

The present invention discloses a primer group and a kit for detecting fragile X syndrome. The kit contains a primer group with fragile X syndrome, the primer set including upstream primer F and downstream primer R was used to detect the CGG repeat numbers of M, as well as for the upstream primer F and downstream primer AGG detection of the insertion of information; such as SEQ ID NO:1 shown in the sequence of the upstream primer F. The 5 'end labeled with FAM; sequence primer R as shown in SEQ ID NO:2; sequence primer M as shown in SEQ ID NO:3. The kit of the invention can detect whether the sample is carried by the pre mutation or full mutation, and avoid missing detection. The method is simple, convenient and fast, and has low cost, and has strong specificity and high sensitivity. It has great application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测脆性X综合征的引物组及其试剂盒
本专利技术属于医学检测
更具体地，涉及一种用于检测脆性X综合征的引物组及其试剂盒。
技术介绍
脆性X综合征是仅次于先天愚型的最常见的遗传性智力障碍类型，发病率为1/2500~1/5000，在我国智力低下患者中发病率约为6.3%。该病发病存在明显的性别差异，男性发病率较高，据统计，男性发病率为1：4000，女性发病率为1:8000~1:6000。脆性X综合征是X染色体DNA过度甲基化或完全改变所致的X连锁不完全显性遗传病。FXS的致病基因为脆性X智力低下1号基因（FMR1），绝大部分FXS是由于FMR1的（CGG）n重复序列过度扩展导致基因甲基化而造成的，只有极少数病例是由FMR1基因点突变或者是完全缺失而造成。正常人的CGG重复数为6~44，最常见的是30次，重复数为55~200的成为“前突变”，重复数超过200的为“全突变”，而重复数为45~54的为“灰色区域”，介于“前突变”和“正常”之间，没有临床表现。影响（CGG）n重复序列的不稳定扩增的主要因素有（CGG）n重复数（重复数越大扩增为全突变的风险越高）、AGG数目及AGG嵌入模式（AGG可增强稳定性）等。在正常人中，（CGG）n重复数增加，AGG插入数目也随之增多，而在脆性X综合征患者中AGG数目比例明显较低，提示AGG的减少可能与患病有关。当有AGG插入时可使（CGG）n序列的化学特性发生变化，插入1个AGG的（CGG）n序列相对没有AGG插入时Tm值下降2℃，2个AGG插入Tm值下降5℃，说明AGG插入不但可影响（CGG）n序列的稳定性，同时显著降低了热力学稳定性，在后代延续上容易造成（CGG）n重复序列的扩展而最终导致脆性X综合征。由此可见，AGG的插入有利于（CGG）n重复序列的稳定遗传。脆性X综合征的主要特征为中度至重度智力低下，且随着年龄增加病情有加重的趋势，其他临床表现为特殊面容，如长脸或招风耳，青春期以后出现大睾丸，许多患者还表现为冲动、多动、焦虑、恐惧社交、语言呆板等孤独症行为。FXS严重危害儿童生长发育，早发现、早治疗、早干预能显著改善患儿预后，且可为家系遗传提供产前遗传咨询，避免家族中再次出现同样的患者，对家庭幸福美满、社会人口素质提高有重大意义，具有不可估量的社会效益和经济效益。本专利技术适用于临床检测脆性X综合征的CGG重复数和AGG插入信息。现有的脆性X综合征检测方法采用PCR技术能够快速地检出结果，避免了荧光探针、MLPA、SouthernBlot等技术操作难度高、检测耗时长、成本高等缺点。但由于GC含量很高，导致该技术对于女性脆性X综合征携带或嵌合体等的检测特异性和灵敏度较低，容易出现假阴性。中国专利（CN103981253A）公开了一种用于检测脆性X染色体综合征的CGG重数及AGG插入信息的PCR试剂盒，该专利针对AGG插入信息的引物为S+(CGG)4AGG，S+(GCG)4GAG，S+(GGC)4GGA或它们的反向互补序列S+(GCC)4TCC，S+(CGC)4CTC，S+(CCG)4CCT，这些引物全部是在AGG的序列上设计的引物，只能识别脆性X综合征野生型的样本，而脆性X综合征样本的DNA的CGG的重复数过高且无AGG插入时，该引物序列对无AGG插入信息的样本无法判断是否为脆性X综合征或实验失败，后续的计算公式亦不适合。因此该专利只能判断正常样本的CGG重复数，而不能判断是否为脆性X综合征携带者，具有较大的局限性。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术中脆性X综合征检测方法存在的缺陷和不足，提供一种用于检测脆性X染色体综合征的CGG重数及AGG插入信息的检测试剂盒。所述试剂盒操作简单、方便快捷、成本低，而且具有较强的特异性和较高的灵敏度，与现有的检测CGG重数及AGG插入信息的试剂盒相比，本专利技术既能够识别出正常样本的CGG重复数，也能够判断是否属于脆性X综合征前突变或全突变的携带者，具有较大的应用前景。本专利技术的目的是提供一种用于检测脆性X染色体综合征的的引物组。本专利技术的另一目的是提供一种检测脆性X染色体综合征的试剂盒。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：一种用于检测脆性X综合征的引物组，包括用于检测CGG重复数的上游引物F和下游引物R，以及用于检测AGG插入信息的上游引物F和下游引物M；所述上游引物F的序列如SEQIDNO：1所示，其5’端带FAM荧光；下游引物R的序列如SEQIDNO：2所示；下游引物M的序列如SEQIDNO：3所示；具体如下所示：F：FAM-5’-TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA-3’（SEQIDNO：1）R：5’-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC-3’（SEQIDNO：2）M：5’-AGCGTCTACTGTCTCGGCACTTGCCCGCCGCCGCCG-3’（SEQIDNO：3）本专利技术在FMR1基因CGG重复序列的两端设计用于扩增检测目标片段（含CGG重复区）的引物F、R，在CGG重复区域设计扩增检测CGG重复序列的引物M，通过对样本进行两个反应体系的荧光PCR扩增，一个体系为扩增CGG重复数片段，另一个体系为扩增插入的AGG信息，然后利用毛细管电泳法检测，可以快速检测脆性X综合征的同时又能够检测样本是否为脆性X综合征携带，使得脆性X综合征的检测方法更为完善。本专利技术针对AGG插入信息的引物5’-AGCGTCTACTGTCTCGGCACTTGCCCGCCGCCGCCG-3’（SEQIDNO：3）为非基因组+（CCG）4，主要针对CGG的重复序列，对于无AGG插入的样本，该峰型为连续峰，对于有AGG信息插入的正常样本或者前突变携带样本，峰型为不连续峰，且根据不连续的缺口数量判断插入的AGG个数，再通过第一个反应的扩增片段判断具体的CGG重复数，既能够识别出正常样本的CGG重复数，也能够判断是否属于脆性X综合征前突变或全突变的携带者。同时，上述引物组在制备脆性X综合征检测试剂盒中的应用亦在本专利技术保护范围内。一种检测脆性X综合征的试剂盒，所述试剂盒包含上述检测引物组。优选地，所述试剂盒还包含DNA聚合酶、PCR增强剂、PCR缓冲液及DNA分子量标准品。优选地，所述试剂盒的扩增反应体系为2×GCBufferⅠ10μL，10mmol/LdNTPs0.4μL，PCR增强剂5.2μL，10μmol/L上下游引物各0.3μL，5U/μLDNA聚合酶0.3μL，模板DNA80ng，ddH2O补足至20μL。优选地，所述试剂盒的扩增反应条件为98℃预变性10min；97℃变性35s，62℃退火35s，68℃延伸4min，33个循环；68℃终延伸10min。上述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：S1.提取样本基因组DNA；S2.以步骤S1所述基因组DNA为模板，利用试剂盒中的引物组分别进行PCR扩增反应；S3.反应结束后，分别将反应产物用毛细管电泳法进行检测，直接分析CGG重复数的范围及AGG的插入个数；所述CGG重复数n=（待测样本片段长度-对照正常样本片段长度）/3+30；所述AGG插入个数为不连续峰的缺口数。优选地，所述毛细管电泳法为将1μLPCR扩增产物加8.5μLHi-Di™本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测脆性X综合征的引物组，其特征在于，包括用于检测CGG重复数的上游引物F和下游引物R，以及用于检测AGG插入信息的上游引物F和下游引物M；所述上游引物F的序列如SEQ ID NO：1所示，其5’端带FAM荧光；下游引物R的序列如SEQ ID NO：2所示；下游引物M的序列如SEQ ID NO：3所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测脆性X综合征的引物组，其特征在于，包括用于检测CGG重复数的上游引物F和下游引物R，以及用于检测AGG插入信息的上游引物F和下游引物M；所述上游引物F的序列如SEQIDNO：1所示，其5’端带FAM荧光；下游引物R的序列如SEQIDNO：2所示；下游引物M的序列如SEQIDNO：3所示。2.权利要求1所述引物组在制备脆性X综合征检测试剂盒中的应用。3.一种检测脆性X综合征的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述引物组。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包含DNA聚合酶、PCR增强剂、PCR缓冲液及DNA分子量标准品。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增反应体系为2×GCBufferⅠ10μL，10mmol/LdNTPs0.4μL，PCR增强剂5.2μL，10μmol/L上下游引物各0.3μL，5U/μLDNA聚合酶0.3μL，模板DNA80ng，ddH2O补足至20μL。6.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明，吴英松，杨学习，杨旭，叶倩平，
申请(专利权)人：广州市达瑞生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44