氧化木糖无色杆菌谷氨酰胺合成酶基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种来源于氧化木糖无色杆菌（

Gene of glutamine synthetase from colorless xylose oxide and its application

The present invention discloses one kind of colorless bacilli derived from xylose oxide.

【技术实现步骤摘要】
氧化木糖无色杆菌谷氨酰胺合成酶基因及其应用
本专利技术属微生物基因工程领域，具体涉及一种来源于氧化木糖无色杆菌的谷氨酰胺合成酶基因及其应用。
技术介绍
草铵膦(DL-phosphinotricinm)是一种广谱触杀型除草剂。其作用原理是抑制植物体内的谷氨酰胺合成酶(Glutaminesynthetase，GS)活性，导致谷氨酰胺合成受阻、氮代谢紊乱、铵离子累积，从而破坏植物细胞膜，阻止植物光合作用而枯死。常规作物不具有抵抗或者降解草铵膦的能力，如果直接接触，草铵膦同样会杀死常规作物。因此为了能够在农作物生长时选择性地除草，农作物需要获得具有抵抗草铵膦的能力或者降解草铵膦的能力。迄今为止，成功用于商业化的抗草铵膦转基因作物的基因是来源于链霉菌的Bar或Pat基因。这两个基因编码的草铵膦乙酰转移酶（PAT）能够催化乙酰辅酶A与草铵膦游离氨基结合，降解被植物吸收的草铵膦，从而消除草铵膦对谷氨酰胺合成酶抑制和植物氨代谢的干扰，赋予植物对草铵膦的耐性。然而，由于目前仅有这两个基因用于抗草铵膦转基因作物的培育，所有就容易在田间管理中引起转基因作物草铵膦抗性降低的担心。所以为了提高转基因作物的抗性水平和增加抗性基因的多样性，生产中仍然需要挖掘新的抗草铵膦的基因和以此基因为基础的抗草铵膦转基因作物。
技术实现思路
本专利技术所要解决的主要问题之一在于提供一种来源于氧化木糖无色杆菌的谷氨酰胺合成酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。本专利技术所要解决的另一主要问题在于提供一种来源于氧化木糖无色杆菌的谷氨酰胺合成酶基因及其表达纯化以及在植物中的应用。本专利技术通过对该酶的动力学参数以及在植物中草铵膦抗性研究，发现本专利技术的谷氨酰胺合成酶基因可用于培育抗草铵膦的转基因作物。为了达到上述目标，本专利技术采用以下技术方案来实现：1）抗草铵膦菌株的筛选收集频繁使用草铵膦的果园地里土壤的样品，用0.9%(w/v)氯化钠溶液混合之后涂布于含有不同浓度草铵膦的LB固体培养基中培养，筛选出高抗草铵膦菌株。2）菌株基因组DNA的提取及鉴定抽提上述筛选出的细菌基因组DNA，储存于4℃下备用。然后以菌株的DNA为模板进行16SrRNA的PCR扩增，以鉴定菌株的菌属。3）基因组文库的构建将上述抽提的细菌基因组DNA用Sau3AI酶切，连接到同样去磷酸化的pACYC184质粒载体。连接产物电击转入大肠杆菌DH5α，涂布于LB固体培养基，37℃下培养24h后进行质粒大量提取。这样就构建成了包含有目的基因的基因组文库。4）新型草铵膦抗性基因的获得将上述大量提取的质粒转入大肠杆菌JW3841-1菌株(CGSC#10775,美国耶鲁大学遗传资源中心)，分别涂布于含有不同浓度草铵膦的LB固体培养基中培养，确定能够抵抗草铵膦的阳性转化子，对其进行质粒提取并测序。根据测序结果合成引物，以测序的质粒为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物即为本专利技术的新型草铵膦抗性基因。4）新型草铵膦抗性基因的人工合成以基因合成法【NucleicAcidsResearch,2004,32,e98】，设计34对引物，人工合成本专利技术的新型草铵膦抗性基因。经序列测定其核苷酸序列如SEQIDNO1所示，编码的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。5）新型基因的体外草铵膦抗性试验将上述所获得的新型草铵膦抗性基因连接到原核表达载体pG251。用大肠杆菌JW3841-1菌株转化后进行体外草铵膦点样抗性试验。6）新型基因的蛋白表达纯化及酶学特性测定将上述所获得的新型草铵膦抗性基因连接到pET-28a载体。然后将此质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司)，转化子用HisTrapHPkit(AmershamBiosciences)试剂盒进行蛋白表达纯化，并进行谷氨酰胺合成酶动力学参数的测定。7）转新型草铵膦抗性基因拟南芥的功能验证将上述获得的新型草铵膦抗性基因采用蘸花法【NatureProtocol,2006,(2):641-646】转入拟南芥，并通过对拟南芥种子的根长生长试验以及拟南芥植株的草铵膦喷洒试验说明本专利技术的来源于氧化木糖无色杆菌的谷氨酰胺合成酶基因有可能用于抗草铵膦转基因作物的培育。附图说明图1本专利技术的来源于氧化木糖无色杆菌的谷氨酰胺合成酶基因的体外草铵膦抗性试验。图2本专利技术的来源于氧化木糖无色杆菌的谷氨酰胺合成酶SDS-PAGE电泳图。1：用HisTrapHP试剂盒纯化的本专利技术的来源于氧化木糖无色杆菌的谷氨酰胺合成酶蛋白；2：在大肠杆菌BL21(DE3)过量表达的本专利技术的来源于氧化木糖无色杆菌的谷氨酰胺合成酶蛋白；M：蛋白分子量MARKER。图3转本专利技术的来源于氧化木糖无色杆菌的谷氨酰胺合成酶基因的拟南芥种子在含有不同浓度草铵膦平板上的根长实验图。左：转本专利技术的氧化木糖无色杆菌的谷氨酰胺合成酶基因的株系；右：CK对照。图4转本专利技术的来源于氧化木糖无色杆菌的谷氨酰胺合成酶基因的拟南芥植株用BASTA溶液喷洒处理的表型图(上行：转本专利技术的氧化木糖无色杆菌的谷氨酰胺合成酶基因的株系；下行：CK对照)。A：喷洒7天后的表型图；B：喷洒14天后的表型图；C：喷洒21天后的表型图。具体实施方式以下结合附图详细描述本专利技术的技术方案。实施例仅用以说明本专利技术的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本专利技术进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对专利技术的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本专利技术的权利要求范围中。本专利技术所用的试剂若未经说明，均购自西格玛－奥德里奇（Sigma－Aldrich）公司。本专利技术涉及的分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书（J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科学出版社）实施例1新型草铵膦抗性基因谷氨酰胺合成酶基因的获得1、土壤样品的采集从一年至少使用四次并且连续使用十年以上的果园的土壤中采集土壤样品。2、抗草铵膦菌株的筛选称取草铵膦频繁使用果园土壤样品1g，加入0.9%（w/v）氯化钠溶液1ml，5000转/分震荡混匀，3000转/分轻离心，倒掉上清，再加入0.9%（w/v）氯化钠溶液1ml，5000转/分震荡混匀，冰上10min静置，吸取150μl溶液涂布与含有20mM草铵膦的LB固体培养基中培养24h。将长出来的单菌落接种与加入1.6mlLB液体培养基的试管中，28℃培养48h，然后吸取150μl的培养液再次涂布与含有50mM草铵膦的LB固体培养基中培养24h，最后将其中一个生长良好的菌落选出来进行进一步研究。3、菌株总DNA的提取及鉴定将上述分离获得的细菌单菌落在10ml液体LB培养基（5g/L酵母提取物，5g/LNaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH=7.5）中培养16h，菌体培养液以6000转/分速度离心5min，得到菌体沉淀，这些沉淀在–20℃下冷冻1h。之后使用TE（10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH=8.0）溶液清洗一次。加入含有20μl浓度为10mg/mL溶菌酶（Sigma-Aldrich）的无菌水悬浮，在37℃下摇床培养1h。加入50μL0.5MEDTA，50μl10%（w/v）SDS和50μl浓度为5M的N本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种来源于氧化木糖无色杆菌（

【技术特征摘要】
1.一种来源于氧化木糖无色杆菌（Achromobacterxylosoxidans）的谷氨酰胺合成酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示。2.根据权利要求1所述的来源于氧...

【专利技术属性】
技术研发人员：田永生，许晶，姚泉洪，彭日荷，王波，付晓燕，韩红娟，高建杰，王丽娟，李振军，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海,31