一种肌红蛋白抗体胶乳微球的偶联方法技术

本发明专利技术公开了一种肌红蛋白抗体胶乳微球的偶联方法，其偶联过程中使用的功能液包括羧基胶乳微球、羊抗人肌红蛋白单克隆抗体、偶联剂、活化液、清洗液、封闭液、保存液，偶联剂包括碳二亚胺、N‑羟基琥珀酰亚胺，本发明专利技术中肌红蛋白抗体偶联微球稳定性好，灵敏度高，抗干扰能力强，易于保存等优点，该偶联方法操作简单，可用于临床中常用的胶乳免疫比浊法检测试剂。

Coupling method of a myoglobin antibody latex microsphere

The invention discloses a method for coupling a myoglobin antibody latex microspheres, the use of functional liquid coupling process including carboxylated latex microspheres, Goat anti human myoglobin monoclonal antibody, coupling agent, activator, cleaning liquid, sealing liquid, liquid storage, coupling agent including carbon two and N hydroxysuccinimide imine, the invention myoglobin antibody conjugated microspheres have good stability, high sensitivity, strong anti-interference ability, easy preservation, the coupling method has the advantages of simple operation, can be used in the clinical commonly used latex immune detection reagent method.

【技术实现步骤摘要】
一种肌红蛋白抗体胶乳微球的偶联方法
本专利技术涉及肌红蛋白的含量检测
，尤其是涉及一种肌红蛋白含量检测过程中的胶乳微球抗体的制备方法。
技术介绍
乳胶颗粒凝集试验能够用于全自动生化分析仪，其通过与血清样本中目的物结合产生浊度的变化，进而反应吸光度值的变化，产生检测信号值，该检测结果是疾病分期、判断预后和指导治疗的一项评判标志。目前，应用较多的检测主要有：酶联免疫吸附试验、免疫过滤胶体金染色法和放免法。其中乳胶颗粒凝集试验法测定速度快，灵敏度较高，结合物物稳定性好，操作简单等优点。综上所述，该方法能够很好的弥补上述其他方法的不足。然而，抗体胶乳微球的偶联方法成为了该检测程序中的关键步骤，采用简单的化学偶联法，保证抗体效价的前提下进行温和，快速的偶联。该方法能够广泛的应用到不同项目的检测试剂中，许多研究报道，肌红蛋白可作为急性心肌梗死诊断的早期最灵敏的指标。但是该蛋白特异性差，在创伤、肾功能衰竭等疾病中，都可导致其升高，导致检测相关项目的增加，时间延长。本专利技术基于肌红蛋白的特性，研发了一种肌红蛋白抗体胶乳微球的偶联方法。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术提供了一种肌红蛋白抗体胶乳微球的偶联方法，该方法仅适用于肌红蛋白抗体与羧基胶乳微球的偶联，该偶联方法能够提供乳胶颗粒凝集试验法测定的灵敏度和抗干扰能力。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种肌红蛋白抗体胶乳微球的偶联方法，其特征在于，包括以下步骤：①制备偶联过程中的功能液，该功能液包括羧基胶乳微球、羊抗人肌红蛋白单克隆抗体、偶联剂、活化液、清洗液、封闭液、保存液，偶联剂包括碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺，所述的活化液由30mM的pH＝6.0的MES缓冲液、10mM的氯化镁、质量分数为0.03％的叠氮钠组成，清洗液由30mM的pH＝7.2磷酸盐缓冲液、质量分数为0.1％的BSA、质量分数为0.03％的叠氮钠组成，封闭液由30mM的pH＝7.2磷酸盐缓冲液、质量分数为5％的BSA、质量分数为0.03％的叠氮钠组成，保存液由30mM的pH＝7.2磷酸盐缓冲液、质量分数为0.1％的BSA、质量分数为0.5％的蔗糖、质量分数为0.03％的叠氮钠组成，所述羧基胶乳微球粒径为90nm，②取5％羧基胶乳微球0.2mL，加入0.8mL活化缓冲剂进行活化处理，活化3次，震荡混匀15min/次，然后以13000r/min的速度离心20min，去掉上清，得到微球沉淀，③于微球沉淀中，加入1mL活化液悬起微球沉淀，进行5min超声混匀形成微球溶液，加入偶联剂，偶联剂与微球溶液的质量比为1:15，偶联剂中的碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:3，偶联剂的加入顺序为：先加入碳二亚胺室温震荡15min，再加入N-羟基琥珀酰亚胺室温震荡15min；④对经步骤③处理后的溶液进行离心处理，以13000r/min的速度离心20min，去掉上清，用清洗液清洗，重复清洗3次，再以9000r/min的速度离心10min，去上清，得到微球；⑤偶联抗体的处理：羊抗人肌红蛋白单克隆抗体经木瓜蛋白酶于37℃下处理15min后，加入体积分数为0.01％的过氧化氢使木瓜该酶失活，得到抗体，⑥将步骤⑤处理好的抗体与步骤④处理过的微球混合，震荡混匀，室温孵育5h，经离心处理，以9000r/min的速度离心10min，去掉上清，⑦用2mL封闭液悬起经步骤⑥处理过的沉淀，震荡混匀4min，其中，前2min静止，然后，放置于冰上震荡1min，撤去冰后继续震荡2min，最后，室温封闭1h；⑧将步骤⑦的液体经离心处理，以9000r/min的速度离心10min，去上清，⑨用2mL保存液悬起经步骤⑧处理过的沉淀，震荡混匀，时间为4min，其中，前2min静止，然后，放置于冰上震荡1min，撤去冰后继续震荡2min，4℃保存。采用上述方案，本专利技术中肌红蛋白抗体偶联微球稳定性好，灵敏度高，抗干扰能力强，易于保存等优点，该偶联方法操作简单，可用于临床中常用的胶乳免疫比浊法检测试剂。下面结合附图对本专利技术作进一步描述。附图说明附图1为本专利技术具体实施例4试剂理论浓度与实际浓度检测结果相关分析图，采用全自动生化分析仪，对40个血清样本进行测定，并对其进行相关分析。其中相关系数：r2＝0.999，线性方程为：y＝1.003x-0.697。具体实施方式本专利技术的保护范围不局限于下述具体实施方式，本领域一般技术人员根据本专利技术公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本专利技术的，或者凡是采用本专利技术的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本专利技术的保护范围。下面实施例描述的是肌红蛋白抗体胶乳微球的偶联方法，其包括以下步骤：①制备偶联过程中的功能液，该功能液包括羧基胶乳微球、羊抗人肌红蛋白单克隆抗体、偶联剂、活化液、清洗液、封闭液、保存液，偶联剂包括碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺，活化液由30mM的pH＝6.0的MES缓冲液、10mM的氯化镁、质量分数为0.03％的叠氮钠组成，清洗液由30mM的pH＝7.2磷酸盐缓冲液、质量分数为0.1％的BSA、质量分数为0.03％的叠氮钠组成，封闭液由30mM的pH＝7.2磷酸盐缓冲液、质量分数为5％的BSA、质量分数为0.03％的叠氮钠组成，保存液由30mM的pH＝7.2磷酸盐缓冲液、质量分数为0.1％的BSA、质量分数为0.5％的蔗糖、质量分数为0.03％的叠氮钠组成，羧基胶乳微球粒径为90nm，②取5％羧基胶乳微球0.2mL，加入0.8mL活化缓冲剂进行活化处理，活化3次，震荡混匀15min/次，然后以13000r/min的速度离心20min，去掉上清，得到微球沉淀，③于微球沉淀中，加入1mL活化液悬起微球沉淀，进行5min超声混匀形成微球溶液，加入偶联剂，偶联剂与微球溶液的质量比为1:15，偶联剂中的碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:3，偶联剂的加入顺序为：先加入碳二亚胺室温震荡15min，再加入N-羟基琥珀酰亚胺室温震荡15min；④对经步骤③处理后的溶液进行离心处理，以13000r/min的速度离心20min，去掉上清，用清洗液清洗，重复清洗3次，再以9000r/min的速度离心10min，去上清，得到微球；⑤偶联抗体的处理：羊抗人肌红蛋白单克隆抗体经木瓜蛋白酶于37℃下处理15min后，加入体积分数为0.01％的过氧化氢使木瓜该酶失活，得到抗体，⑥将步骤⑤处理好的抗体与步骤④处理过的微球混合，震荡混匀，室温孵育5h，经离心处理，以9000r/min的速度离心10min，去掉上清，⑦用2mL封闭液悬起经步骤⑥处理过的沉淀，震荡混匀4min，其中，前2min静止，然后，放置于冰上震荡1min，撤去冰后继续震荡2min，最后，室温封闭1h；⑧将步骤⑦的液体经离心处理，以9000r/min的速度离心10min，去上清，⑨用2mL保存液悬起经步骤⑧处理过的沉淀，震荡混匀，时间为4min，其中，前2min静止，然后，放置于冰上震荡1min，撤去冰后继续震荡2min，4℃保存。检测过程中应用的试剂1是由30mM的pH＝7.2磷酸盐缓冲液、质量分数为0.5％的PEG-6000和质量分数为0.03％的叠氮钠组成的。将经上述方法处理后的肌红蛋白抗体胶乳微球作为试剂2进行分析检测；检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肌红蛋白抗体胶乳微球的偶联方法，其特征在于，包括以下步骤：①制备偶联过程中的功能液，该功能液包括羧基胶乳微球、羊抗人肌红蛋白单克隆抗体、偶联剂、活化液、清洗液、封闭液、保存液，偶联剂包括碳二亚胺、N‑羟基琥珀酰亚胺，所述的活化液由30mM的pH＝6.0的MES缓冲液、10mM的氯化镁、质量分数为0.03％的叠氮钠组成，清洗液由30mM的pH＝7.2磷酸盐缓冲液、质量分数为0.1％的BSA、质量分数为0.03％的叠氮钠组成，封闭液由30mM的pH＝7.2磷酸盐缓冲液、质量分数为5％的BSA、质量分数为0.03％的叠氮钠组成，保存液由30mM的pH＝7.2磷酸盐缓冲液、质量分数为0.1％的BSA、质量分数为0.5％的蔗糖、质量分数为0.03％的叠氮钠组成，所述羧基胶乳微球粒径为90nm，②取5％羧基胶乳微球0.2mL，加入0.8mL活化缓冲剂进行活化处理，活化3次，震荡混匀15min/次，然后以13000r/min的速度离心20min，去掉上清，得到微球沉淀，③于微球沉淀中，加入1mL活化液悬起微球沉淀，进行5min超声混匀形成微球溶液，加入偶联剂，偶联剂与微球溶液的质量比为1:15，偶联剂中的碳二亚胺、N‑羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:3，偶联剂的加入顺序为：先加入碳二亚胺室温震荡15min，再加入N‑羟基琥珀酰亚胺室温震荡15min；④对经步骤③处理后的溶液进行离心处理，以13000r/min的速度离心20min，去掉上清，用清洗液清洗，重复清洗3次，再以9000r/min的速度离心10min，去上清，得到微球；⑤偶联抗体的处理：羊抗人肌红蛋白单克隆抗体经木瓜蛋白酶于37℃下处理15min后，加入体积分数为0.01％的过氧化氢使木瓜该酶失活，得到抗体，⑥将步骤⑤处理好的抗体与步骤④处理过的微球混合，震荡混匀，室温孵育5h，经离心处理，以9000r/min的速度离心10min，去掉上清，⑦用2mL封闭液悬起经步骤⑥处理过的沉淀，震荡混匀4min，其中，前2min静止，然后，放置于冰上震荡1min，撤去冰后继续震荡2min，最后，室温封闭1h；⑧将步骤⑦的液体经离心处理，以9000r/min的速度离心10min，去上清，⑨用2mL保存液悬起经步骤⑧处理过的沉淀，震荡混匀，时间为4min，其中，前2min静止，然后，放置于冰上震荡1min，撤去冰后继续震荡2min，4℃保存。...

【技术特征摘要】
1.一种肌红蛋白抗体胶乳微球的偶联方法，其特征在于，包括以下步骤：①制备偶联过程中的功能液，该功能液包括羧基胶乳微球、羊抗人肌红蛋白单克隆抗体、偶联剂、活化液、清洗液、封闭液、保存液，偶联剂包括碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺，所述的活化液由30mM的pH＝6.0的MES缓冲液、10mM的氯化镁、质量分数为0.03％的叠氮钠组成，清洗液由30mM的pH＝7.2磷酸盐缓冲液、质量分数为0.1％的BSA、质量分数为0.03％的叠氮钠组成，封闭液由30mM的pH＝7.2磷酸盐缓冲液、质量分数为5％的BSA、质量分数为0.03％的叠氮钠组成，保存液由30mM的pH＝7.2磷酸盐缓冲液、质量分数为0.1％的BSA、质量分数为0.5％的蔗糖、质量分数为0.03％的叠氮钠组成，所述羧基胶乳微球粒径为90nm，②取5％羧基胶乳微球0.2mL，加入0.8mL活化缓冲剂进行活化处理，活化3次，震荡混匀15min/次，然后以13000r/min的速度离心20min，去掉上清，得到微球沉淀，③于微球沉淀中，加入1mL活化液悬起微球沉淀，进行5min超声混匀形成微球溶液，加入偶联剂，偶联剂与微球溶液的质量比为1:15，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王贤俊，何丹，
申请(专利权)人：王贤俊，
类型：发明
国别省市：浙江,33