神经源性因子和胶质生成性因子及其测定制造技术

本文中公开了用于测量物质或物质的来源促进神经发生和胶质生成的潜能的定量测定。还公开了促进神经发生和胶质生成的物质。

Neurogenic and glial factors and their determination

In this article, the quantitative determination of the potential of the sources of substances or substances to promote neurogenesis and glia formation is disclosed in this paper. Substances that promote neurogenesis and glial formation are also disclosed.

【技术实现步骤摘要】
神经源性因子和胶质生成性因子及其测定本申请是申请号为201280048345.3的分案申请。相关申请的参考本申请要求2011年8月19日提交的美国临时专利申请号61/575,378和2011年12月28日提交的美国临时专利申请号61/580,991的利益；为了所有目的将所述美国临时专利申请的说明书和附图通过引用整体并入本文。关于联邦政府资助的声明不适用领域本申请涉及促进神经发生和胶质生成的物质以及用于这样的物质的测定的领域。背景间充质基质细胞包括一群称为间充质干细胞的多潜能干细胞(综述于[1]中)。成年哺乳动物的间充质干细胞(MSC)的主要来源是骨髓；获自骨髓的多潜能干细胞被称为下列不同名称：间充质干细胞(MSC)、骨髓粘附基质细胞(MASC)、骨髓粘附干细胞和骨髓基质细胞(BMSC)。间充质干细胞已被作为用于神经组织修复的潜在细胞疗法进行了研究(综述于[2]中)。MSC或MSC衍生物至神经系统的移植已显示在神经变性疾病包括中风、帕金森病、脊髓损伤、多发性硬化和新生儿缺氧缺血性脑损伤的许多模型中是有益的[3-9]。目前的证据表明MSC或其衍生物的移植激活受损神经组织[9-13]和正常脑组织[14]中的内源性再生机制。这些再生过程包括内源神经干细胞的增强的增殖、新生儿神经元的增加的存活[10-11],胶质生成[7]以及炎症细胞因子产生的调节[15]。据认为神经保护作用和神经增殖的增强至少部分是通过由移植的细胞分泌的可扩散的神经营养因子和细胞因子介导的。事实上，已显示MSC在培养物中分泌许多生长因子[16,17]；并且分泌的生长因子的身份在神经变性环境中可通过移植来调节[18,19]。因此重要的是鉴定由MSC及其衍生物产生的负责间充质细胞的神经源性活性和胶质生成活性的因子。MSC与神经细胞之间的体外相互作用的研究对产生适合于几种不同细胞类型(例如，神经元、神经胶质细胞、神经干细胞、间充质细胞)的培养条件提出了挑战，每一种类型对基底和生长培养基具有不同的要求。事实上，在大多数系统中，共培养条件(例如，血清的存在或不存在，或使用MSC单层作为少数神经细胞的基底)选择性地偏爱某些细胞，但以牺牲其它细胞为代价，这导致不一致的结果[23-26]并且阻止了MSC作用的充分定量。例如，某些培养系统有利于神经元但非神经胶质细胞的生长；还未发现同时支持神经前体细胞和3个主要类型的神经细胞(神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞)的生长的系统。MSC和其它物质对神经干细胞的增殖和至不同神经谱系的分化(即，神经发生)的作用通常使用丝裂原驱动的神经球作为神经干细胞/早期前体细胞的来源在体外进行研究；随后通过将神经球涂铺在粘附基底上并且撤除促有丝分裂生长因子来诱导它们的分化[23-26]。然而，神经球中的细胞可能不反映神经前体细胞的天然库，因为它们的生长条件会选取对于非生理性的高浓度的生长因子和非附着型生长的响应者[27,28]。从而有可能的是，在共培养开始时，来源于神经球的细胞可能已被培养条件重编程。此外，在神经球共培养实验中，神经干细胞前体的生长状态难以观察，因为其存在于神经球自身内部的“盲点”中。最后，通过细胞附着状态的改变对神经分化的诱导可能在神经球系统中掩盖测试物质的作用。为了上述原因，能够定量在相同条件下神经源性和胶质生成性因子对神经前体细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的作用的系统仍然是不可获得的SB623细胞是通过用编码Notch1细胞内结构域的载体转染MSC从MSC衍生而来的。参见，例如，美国专利号7,682,825。先前的工作已显示由人MSC和从其衍生的SB623细胞产生的ECM在无添加的因子或血清的情况下有效地支持大鼠胚胎皮层细胞的生长和分化(29，也参见US2010/0310529，为了描述由MSC和SB623细胞产生的ECM的某些性质，将其公开内容通过引用整体并入本文)。如上所述，仍然存在对这样的简单精确的体外系统的需要：所述体外系统建立具有神经源性和/或胶质生成活性的物质(例如，MSC及其衍生物例如SB623细胞)与神经细胞的复杂群体的相互作用的模型，并定量这样的物质的效力。概述本文中提供了用于在最优化定量影响培养物中的不同神经细胞的生长和分化的因子的作用之能力的条件下，共培养MSC和/或其衍生物(例如，SB623细胞)与神经细胞群体的体外系统。这些培养系统可用于提供用于测量物质(例如,MSC及其衍生物，例如SB623细胞、条件化培养基、多肽、有机化合物)对不同类型的神经细胞(例如神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞)的作用的定量功能测定。具体地，可鉴定和定量神经营养性、神经源性、胶质营养性和胶质生成性因子以及这类因子的来源。通过使用本文中描述的测定，已鉴定了许多具有神经源性活性和胶质生成活性的物质。因此，本公开内容提供了，除其它以外，下列实施方案。1.一种用于测试促进神经发生的物质的方法，所述方法包括：(a)在固体基底上培养间充质干细胞(MSC)；(b)从基底除去MSC，以便由MSC产生的细胞外基质保留在所述基底上；(c)在步骤(b)的基底上培养胚胎皮层细胞；(d)将物质添加至步骤(c)的培养物中；和(e)测量神经元的生长；其中神经元的生长表明所述物质促进神经发生。2.实施方案1的方法，其中所述MSC获自人。3.实施方案1的方法，其中所述固体基底选自塑料、硝酸纤维素和玻璃。4.实施方案1的方法，其中所述胚胎皮层细胞获自小鼠或大鼠。5.实施方案1的方法，其中所述物质是化合物或多肽。6.实施方案1的方法，其中所述物质是细胞或细胞培养物。在某些实施方案中，所述细胞是间充质干细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞的后代(SB623细胞)。7.实施方案6的方法，其中在细胞表面表达的蛋白质促进神经发生。8.实施方案1的方法，其中所述物质是来自细胞培养物的条件化培养基。9.实施方案1的方法，其中神经元的生长通过轴突生长物或通过选自微管相关蛋白2(MAP2)、双皮质素(DCX)、β-微管蛋白III型(TuJ1)、突触囊泡蛋白和神经元特异性烯醇化酶的标志物的表达来测量。10.实施方案1的方法，其中将神经元的生长与不存在所述物质的情况下神经元的生长相比较。11.一种用于测试促进胶质生成的物质的方法，所述方法包括：(a)在固体基底上培养间充质干细胞(MSC)；(b)从基底除去MSC，以便由MSC产生的细胞外基质保留在所述基底上；(c)在步骤(b)的基底上培养胚胎皮层细胞；(d)将物质添加至步骤(c)的培养物中；和(e)测量神经胶质细胞的生长；其中神经胶质细胞的生长表明所述物质促进胶质生成。12.实施方案11的方法，其中所述MSC获自人。13.实施方案11的方法，其中所述固体基底选自塑料、硝酸纤维素和玻璃。14.实施方案11的方法，其中所述胚胎皮层细胞获自小鼠或大鼠。15.实施方案11的方法，其中所述物质是化合物或多肽。16.实施方案11的方法，其中所述物质是细胞或细胞培养物。在某些实施方案中，所述细胞是间充质干细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞的后代(SB623细胞)。17.实施方案16的方法，其中在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于确定物质是否促进神经前体细胞分化的定量测定法，所述测定法包括下列步骤：(a)在固体基底上培养间充质细胞；(b)从基底除去所述间充质细胞，以便由所述间充质细胞产生的细胞外基质保留在所述基底上；(c)在不存在生长因子的情况下在步骤(b)的基底上铺板胚胎皮层细胞以形成测定培养物；(d)将测试物质添加至步骤(c)的测定培养物中，其中(i)使用多个测定培养物；和(ii)将不同浓度的测试物质添加至所述多个测定培养物中的每一个；和(e)在预先确定的时间段之后，测量所述测定培养物中下列一个或多个的表达：微管相关蛋白2(MAP2)、双皮质素(DCX)、神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)和环核苷酸3'磷酸二酯酶(CNPase)；其中与步骤(e)的培养物中的测试物质的量成比例的MAP2或DCX的表达指示所述物质促进神经前体细胞分化为神经元；进一步地，其中与步骤(e)的培养物中的测试物质的量成比例的GFAP的表达指示所述物质促进神经前体细胞分化为星形细胞；和进一步地，其中与步骤(e)的培养物中的测试物质的量成比例的CNPase的表达指示所述物质促进神经前体细胞分化为少突胶质细胞。

【技术特征摘要】
2011.08.19 US 61/575,378;2011.12.28 US 61/580,9911.一种用于确定物质是否促进神经前体细胞分化的定量测定法，所述测定法包括下列步骤：(a)在固体基底上培养间充质细胞；(b)从基底除去所述间充质细胞，以便由所述间充质细胞产生的细胞外基质保留在所述基底上；(c)在不存在生长因子的情况下在步骤(b)的基底上铺板胚胎皮层细胞以形成测定培养物；(d)将测试物质添加至步骤(c)的测定培养物中，其中(i)使用多个测定培养物；和(ii)将不同浓度的测试物质添加至所述多个测定培养物中的每一个；和(e)在预先确定的时间段之后，测量所述测定培养物中下列一个或多个的表达：微管相关蛋白2(MAP2)、双皮质素(DCX)、神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)和环核苷酸3'磷酸二酯酶(CNPase)；其中与步骤(e)的培养物中的测试物质的量成比例的MAP2或DCX的表达指示所述物质促进神经前体细胞分化为神经元；进一步...

【专利技术属性】
技术研发人员：I·艾兹曼，C·C·凯斯，
申请(专利权)人：桑比欧公司，
类型：发明
国别省市：美国,US