一种从尿液中检测骨骼肌微损伤标志物肌红蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种从尿液中检测骨骼肌微损伤标志物肌红蛋白的方法，包括缓冲液配置、分散液A配置、分散液B配置、标液配置、标样检测和样品检测，分散液A为含有NiFe2O4‑CMCS‑antibody免疫磁纳米颗粒的溶液，分散液B为含有SNP‑ZnSe/ZnS‑antibody免疫荧光纳米球的溶液。本发明专利技术以NiFe2O4‑CMCS复合纳米颗粒为载体，结合肌红蛋白抗体，与尿液中的肌红蛋白结合形成免疫复合物，再结合负载在SNP‑ZnSe/ZnS荧光纳米球上的酶标肌红蛋白抗体，通过检测荧光强度实现了对肌红蛋白的定量检测，该方法具有灵敏度较高、抗干扰性较强、重复性较好等特点。

A method for detecting myoglobin of skeletal muscle micro damage markers from urine

The invention relates to the technical field of medical detection, and particularly relates to a detection method of skeletal muscle micro injury markers myoglobin from urine, including buffer allocation, dispersion, dispersion of A configuration B configuration, standard solution configuration, sample detection and sample detection, dispersion A solution containing NiFe2O4 CMCS antibody immune magnetic nanoparticles, dispersion of B solution containing SNP ZnSe/ZnS antibody fluorescent nanospheres. The present invention uses NiFe2O4 CMCS composite nanoparticles as the carrier, combined with myoglobin antibody, combined with urine myoglobin in the formation of immune complexes, combined with the load in the SNP ZnSe/ZnS fluorescence nanospheres on enzyme labeled myoglobin antibody, by detecting the fluorescence intensity to achieve quantitative detection of myoglobin, this method has high sensitivity, anti-interference strong, good repeatability etc..

【技术实现步骤摘要】
一种从尿液中检测骨骼肌微损伤标志物肌红蛋白的方法
本专利技术涉及医学检测
，尤其涉及一种从尿液中检测骨骼肌微损伤标志物肌红蛋白的方法。
技术介绍
运动性骨骼肌微损伤是一种高强度或/和长时间运动后发生的骨骼肌纤维的微细损伤，不同于运动创伤学中的肌肉挫伤、拉伤等，常表现肌肉酸痛。肌肉酸痛是由剧烈的、超过习惯负荷的骨骼肌舒缩活动所引起的，特别是在骨骼肌进行离心收缩后最容易发生。具体表现为，通常在运动结束后24h出现、24h～48h达高峰、持续5d～7d或更长时间后逐渐缓解、消失；肌肉酸痛程度与肌肉活动的剧烈程度、持续时间以及骨骼肌收缩形式相关，如离心收缩＞等长收缩＞向心收缩；肌肉酸痛同时伴有肌力减退、僵硬、活动功能下降等，肌电图、血清酶及超微结构形态均有不同程度的改变。军事训练伤防控不仅依赖于科学施训，更应当重视医务监督对训练伤发生预测及现场监测中的重要作用。战士在军事训练中常出现疲劳积累并造成过度疲劳综合征，继续坚持训练往往易发生训练伤病，尤其是骨骼肌微损伤的肌肉酸痛症状具有延迟性，需要运动后一段时间才能知晓。因此，如何早期诊断运动性疲劳是预防训练伤病的关键。业已证明，肌红蛋白是评定肌肉承受训练刺激、运动性疲劳及骨骼肌微损伤的敏感标志物。肌红蛋白(Mb)是一种小分子单体血红素蛋白，存在于肌细胞中，其功能是储存和运输氧气，即把血液中的氧通过细胞膜运输到肌细胞中，以氧合Mb的形式暂时储存，保证肌肉剧烈活动时对氧的需要，因此Mb对运动能力有重要作用。此外Mb对微血管和组织中的一氧化氮具有调节作用，促进血红素中的Fe3+释放并造成线粒体膜脂质过氧化。剧烈运动后Mb在30min内升高并可持续数天，故可作为训练负荷的监控指标。当肌肉组织受损伤时，Mb可大量释放至细胞外进入血循环，一旦血浆中出现肌红蛋白，因其相对分子质量较小可迅速通过肾小球滤过而由肾脏排出，其浓度超过肾阈，出现肌红蛋白尿，尿液呈粉红色，但很快变为棕色或棕黑色。因此，可以通过从尿液中检测肌红蛋白浓度判断是否发生骨骼肌微损伤，为科学施训提供参考指导数据。目前临床常用检测肌红蛋白的方法多用于血液中肌红蛋白的检测，主要有ELISA法、胶体金法和化学发光法等。其中ELISA法适合大批量检测，但重复性差，操作复杂；胶体金法特异性相对较好，但敏感度偏低；化学发光法灵敏度高，特异性好，但成本要求过高。从血液中检测肌红蛋白必定会涉及血液的采集，这会给施训人员带来痛苦，从尿液中检测肌红蛋白可以取样对施训人员造成的痛苦，但是目前相关检测方法报道较少，因此需要寻找一种能够快速从尿液中检测肌红蛋白的高灵敏度、抗干扰性强、重复性好的方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是提供一种从尿液中检测骨骼肌微损伤标志物肌红蛋白的方法，该方法以NiFe2O4-CMCS复合纳米颗粒为载体，与尿液中的肌红蛋白结合形成免疫复合物，再结合负载在SNP-ZnSe/ZnS荧光纳米球上的酶标肌红蛋白抗体，通过检测荧光强度实现了对肌红蛋白的定量检测，该方法具有灵敏度较高、抗干扰性较强、重复性较好等特点。本专利技术通过以下技术手段解决上述技术问题：一种从尿液中检测骨骼肌微损伤标志物肌红蛋白的方法，包括以下步骤：缓冲液配置：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液与0.2mol/L氢氧化钠溶液按体积比10:7混合，加去离子水稀释混匀得到pH＝7.2的10mmol/L的PB缓冲液，取吗啉乙磺酸和盐酸溶液加入去离子水中混匀得到pH＝6.5的10mmol/L的MES缓冲液。分散液A配置：取NiFe2O4-CMCS复合纳米颗粒，加入EDC溶液和NHS溶液搅拌,磁分离洗涤后的纳米颗粒与9.5mg/mL肌红蛋白抗体溶液反应，磁分离洗涤得到NiFe2O4-CMCS-antibody免疫磁纳米颗粒，浸入保存液中，保存于0℃～5℃的冰箱中。分散液B配置：取SNP-ZnSe/ZnS荧光纳米球，加入EDC溶液和NHS溶液搅拌,磁分离洗涤后的纳米球与9.5mg/mL酶标肌红蛋白抗体溶液反应，磁分离洗涤得到SNP-ZnSe/ZnS-antibody免疫荧光纳米球，浸入保存液中，保存于0℃～5℃的冰箱中。标液配置：精确称取3份以上不同质量的肌红蛋白标准品分别加入不同试管中，向各试管中移取PB缓冲液振荡溶解，配制成不同浓度的标准储备液，保存于0℃～5℃的冰箱中。标样检测：取400μL标准储备液用PB缓冲液稀释至1mL，加入150μL分散液A，振荡15min后，再加入150μL分散液B，继续振荡15min后，用PB缓冲液磁分离洗涤3次以上，再均匀分散于250μL的PB缓冲液中，用荧光分光光度计进行荧光检测得到荧光值，以标准储备液的浓度为横坐标，对应的荧光值为纵坐标绘制拟合标准曲线。样品检测：取中段尿液于冷冻离心机中离心10min～15min，取上清液搅拌加入硫酸铵至液体饱和，过滤得到样品液，取350μL～380μL样品液用PB缓冲液稀释至1mL，加入120μL～150μL分散液A，振荡8min～15min后，再加入120μL～150μL分散液B，振荡8min～15min后，用PB缓冲液磁分离洗涤3次以上，再均匀分散于250μL的PB缓冲液中，进行荧光检测得到荧光值，将荧光值带入标准曲线中便得到相应的浓度值，即完成尿液中肌红蛋白的检测。进一步，所述保存液为含有0.1％BSA、0.03％吐温-20的PB缓冲液。进一步，所述分散液A的配置方法如下：取NiFe2O4-CMCS用PB缓冲液磁分离洗涤3次以上后，加入2mLPB缓冲液中，配制得到浓度为10mg/mL的溶液，加入85μL0.1mol/L的EDC溶液和125μL0.1mol/L的NHS溶液，搅拌0.5h，PB缓冲液磁分离洗涤3次，再均匀分散于2mLPB缓冲液中，搅拌加入3.5μL肌红蛋白抗体溶液，振荡10min，静置1h，慢速搅拌10min～15min，PB缓冲液磁分离洗涤3次，再加入2mLPB缓冲液中，加入150μL0.1mol/L盐酸羟胺溶液搅拌1.5h，磁分离得到的NiFe2O4-CMCS-antibody固相产物，用PB缓冲液磁分离洗涤3次，浸入2mL0℃～5℃的保存液中。进一步，所述NiFe2O4-CMCS复合纳米颗粒是以纳米铁酸镍为核心外包覆羧甲基壳聚的多面体多孔颗粒，所述NiFe2O4-CMCS颗粒制备如下：将等摩尔量的羧甲基壳聚糖和NiFe2O4纳米颗粒超声溶于去离子水中搅拌混匀得到分散相，将聚山梨酯-80和司盘80加入矿物油混匀得到连续相，于连续相中加入分散相搅拌1.5h,再加入戊二醛反应2.5h，过滤得到的颗粒物先后用石油醚、去离子水和乙醇洗涤，于55℃真空干燥10h～13h，得到NiFe2O4-CMCS纳米颗粒。进一步，所述NiFe2O4纳米颗粒的制备如下，取FeSO4·7H2O和NiSO4·6H2O加入草酸铵溶液中混合，搅拌反应，过滤得到NiFe2O4溶胶，将NiFe2O4溶胶加入去离子水中，超声分散1h，加入乙酸乙酯和三聚氰胺，于150℃水热反应釜中反应5h后，蒸馏，真空干燥,粉碎，于500℃～750℃氮气-氢气混合气流动下热处理5h，并于500℃～750℃空气气流中热处理5h，取出，洗涤过滤，干燥研磨得到NiFe2O4纳米颗粒。进一步，所述分散液B的配置方法如本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从尿液中检测骨骼肌微损伤标志物肌红蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：缓冲液配置：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液与0.2mol/L氢氧化钠溶液按体积比10:7混合，加去离子水稀释混匀得到pH＝7.2的10mmol/L的PB缓冲液，取吗啉乙磺酸和盐酸溶液加入去离子水中混匀得到pH＝6.5的10mmol/L的MES缓冲液；分散液A配置：取NiFe2O4‑CMCS复合纳米颗粒，加入EDC溶液和NHS溶液搅拌,磁分离洗涤后的纳米颗粒与9.5mg/mL肌红蛋白抗体溶液反应，磁分离洗涤得到NiFe2O4‑CMCS‑antibody免疫磁纳米颗粒，浸入保存液中，保存于0℃～5℃的冰箱中；分散液B配置：取SNP‑ZnSe/ZnS荧光纳米球，加入EDC溶液和NHS溶液搅拌,磁分离洗涤后的纳米球与9.5mg/mL酶标肌红蛋白抗体溶液反应，磁分离洗涤得到SNP‑ZnSe/ZnS‑antibody免疫荧光纳米球，浸入保存液中，保存于0℃～5℃的冰箱中；标液配置：精确称取3份以上不同质量的肌红蛋白标准品分别加入不同试管中，向各试管中移取PB缓冲液振荡溶解，配制成不同浓度的标准储备液，保存于0℃～5℃的冰箱中；标样检测：按以下方法分别测定不同浓度标准储备液的荧光值，取400μL标准储备液用PB缓冲液稀释至1mL，加入150μL分散液A，振荡15min后，再加入150μL分散液B，继续振荡15min后，用PB缓冲液磁分离洗涤3次以上，再均匀分散于250μL的PB缓冲液中，用荧光分光光度计进行荧光检测得到荧光值，以标准储备液的浓度为横坐标，对应的荧光值为纵坐标绘制拟合标准曲线；样品检测：取中段尿液于冷冻离心机中离心10min～15min，取上清液搅拌加入硫酸铵至液体饱和，过滤得到样品液，取350μL～380μL样品液用PB缓冲液稀释至1mL，加入120μL～150μL分散液A，振荡8min～15min后，再加入120μL～150μL分散液B，振荡8min～15min后，用PB缓冲液磁分离洗涤3次以上，再均匀分散于250μL的PB缓冲液中，进行荧光检测得到荧光值，将荧光值带入标准曲线中便得到相应的浓度值，即完成尿液中肌红蛋白的检测。...

【技术特征摘要】
1.一种从尿液中检测骨骼肌微损伤标志物肌红蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：缓冲液配置：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液与0.2mol/L氢氧化钠溶液按体积比10:7混合，加去离子水稀释混匀得到pH＝7.2的10mmol/L的PB缓冲液，取吗啉乙磺酸和盐酸溶液加入去离子水中混匀得到pH＝6.5的10mmol/L的MES缓冲液；分散液A配置：取NiFe2O4-CMCS复合纳米颗粒，加入EDC溶液和NHS溶液搅拌,磁分离洗涤后的纳米颗粒与9.5mg/mL肌红蛋白抗体溶液反应，磁分离洗涤得到NiFe2O4-CMCS-antibody免疫磁纳米颗粒，浸入保存液中，保存于0℃～5℃的冰箱中；分散液B配置：取SNP-ZnSe/ZnS荧光纳米球，加入EDC溶液和NHS溶液搅拌,磁分离洗涤后的纳米球与9.5mg/mL酶标肌红蛋白抗体溶液反应，磁分离洗涤得到SNP-ZnSe/ZnS-antibody免疫荧光纳米球，浸入保存液中，保存于0℃～5℃的冰箱中；标液配置：精确称取3份以上不同质量的肌红蛋白标准品分别加入不同试管中，向各试管中移取PB缓冲液振荡溶解，配制成不同浓度的标准储备液，保存于0℃～5℃的冰箱中；标样检测：按以下方法分别测定不同浓度标准储备液的荧光值，取400μL标准储备液用PB缓冲液稀释至1mL，加入150μL分散液A，振荡15min后，再加入150μL分散液B，继续振荡15min后，用PB缓冲液磁分离洗涤3次以上，再均匀分散于250μL的PB缓冲液中，用荧光分光光度计进行荧光检测得到荧光值，以标准储备液的浓度为横坐标，对应的荧光值为纵坐标绘制拟合标准曲线；样品检测：取中段尿液于冷冻离心机中离心10min～15min，取上清液搅拌加入硫酸铵至液体饱和，过滤得到样品液，取350μL～380μL样品液用PB缓冲液稀释至1mL，加入120μL～150μL分散液A，振荡8min～15min后，再加入120μL～150μL分散液B，振荡8min～15min后，用PB缓冲液磁分离洗涤3次以上，再均匀分散于250μL的PB缓冲液中，进行荧光检测得到荧光值，将荧光值带入标准曲线中便得到相应的浓度值，即完成尿液中肌红蛋白的检测。2.根据权利要求1所述的一种从尿液中检测骨骼肌微损伤标志物肌红蛋白的方法，其中，所述保存液为含有0.1％BSA、0.03％吐温-20的PB缓冲液。3.根据权利要求2所述的一种从尿液中检测骨骼肌微损伤标志物肌红蛋白的方法，其中，所述分散液A的配置方法如下：取NiFe2O4-CMCS用PB缓冲液磁分离洗涤3次以上后，加入2mLPB缓冲液中，配制得到浓度为10mg/mL的溶液，加入85μL0.1mol/LEDC的溶液和125μL0.1mol/L的NHS溶液，搅拌0.5h，PB缓冲液磁分离洗涤3次，再均匀分散于2mLPB缓冲液中，搅拌加入3.5μL肌红蛋白抗体溶液，振荡10min，静置1h，慢速搅拌10min～15min，PB缓冲液磁分离洗涤3次，再加入2mLPB缓冲液中，加入150μL0.1mol/L盐酸羟胺溶液搅拌1.5h，磁分离得到的NiFe2O4-CMCS-antibody固相产物，用PB缓冲液磁分离洗涤3次，浸入2mL0℃～5℃的保存液中。4.根据权利要求3所述的一种从尿液中检测骨骼肌微损伤标志物肌红蛋白的方法，其中，所述NiFe...

【专利技术属性】
技术研发人员：糜漫天，易龙，张乾勇，周曦，郎和东，吴璐婷，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50