本发明专利技术公开了一种斑点叉尾鮰微卫星家系鉴定方法。其步骤包括①采用人工繁殖的方法繁育斑点叉尾鮰家系，100个家系子代混合养殖在同一池塘；②采用荧光标记引物和多重PCR扩增方法分析斑点叉尾鮰选育群体在18个微卫星标记位点的基因型，筛选出10个多态性高、适合家系鉴定的有效微卫星标记；③优化10个微卫星标记多重PCR扩增体系，分析混养家系子代在10个微卫星位点的基因型；④根据亲本与子代基因型，鉴定各子代的亲本来源。本发明专利技术首次在斑点叉尾鮰上建立了亲子鉴定的方法，其鉴定准确率达到了96.6％，能够快速准确鉴定斑点叉尾鮰混养个体亲本。本发明专利技术可以快速、准确地对斑点叉尾鮰混养个体进行家系鉴定，提高选育效果。
【技术实现步骤摘要】
一种斑点叉尾鮰微卫星家系鉴定方法
本专利技术属于鱼类遗传育种的分子标记
，具体涉及一种利用荧光标记微卫星鉴定斑点叉尾鮰混养家系子代双亲的方法。
技术介绍
斑点叉尾鮰原产于美国，是一种重要的水产经济物种，1984年引入我国。因其具有肉质细嫩，营养丰富，出肉率高，没有肌间刺等优点，深受广大消费者欢迎。随着我国斑点叉尾鮰养殖规模的扩大以及美国对华种质供应限制力度的加大，我国养殖斑点叉尾鮰出现了明显的生长减慢、体色分化、规格不齐和病害频发等种质衰退的现象，严重影响了斑点叉尾鮰的产品品质、产量和养殖效益。因此，开展斑点叉尾鮰品种改良工作，培育生长快、经济性状好、抗逆性强的斑点叉尾鮰新品种(系)已成为当前斑点叉尾鮰产业可持续发展亟待解决的重要问题。在鱼类遗传育种中，准确的系谱信息对于遗传力、育种值的计算和育种方案的制定具有至关重要的作用。在传统的选育过程中，不同家系主要通过物理隔离的方式分开养殖，等到子代个体长到较大规格时采用注射荧光染料或电子标记等方式区分不同家系个体。对不同家系采取水泥池、网箱隔离养殖的方式，不仅管理难度大，更为关键的是分养池之间在环境因子上会存在差异，不同的环境因素会使育种相关的遗传参数估计产生偏差，不利于育种方案的制定。微卫星标记具有多态性高、稳定性强、特异性高、共显性遗传等优点。微卫星分子标记技术的出现使得混养水产动物亲子关系的鉴定成为可能，以微卫星分型为基础的亲子鉴定技术是目前水产动物系谱确认中应用最广泛最可靠的手段之一。众多研究表明微卫星标记在确认水产动物父母本和分析家系关系方面具有重要的应用价值。因此，开发出一套基于微卫星分子标记的快速、准确鉴定斑点叉尾鮰亲子关系的技术体系对斑点叉尾鮰育种工作的开展具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种斑点叉尾鮰微卫星家系鉴定方法，为斑点叉尾鮰分子育种提供必要的分子标记，该方法具有鉴别准确率高、不需将各家系隔离养殖等优点，主要是通过斑点叉尾鮰微卫星标记位点进行多重PCR扩增和基因分型检测来实现。本专利技术专利所采取的技术方案：一种斑点叉尾鮰微卫星家系鉴定方法，包括如下步骤：(1)提取混养的亲本和子代斑点叉尾鮰的基因组DNA，并检测质量和浓度(2)多态性微卫星标记筛选和引物合成选取10个微卫星位点引物，按照PCR扩增片段大小分为2组，在正向引物的5’端分别用FAM、HEX两种不同的荧光基团进行修饰，用于多重PCR扩增；所述的10对微卫星位点引物的核苷酸序列分别为：第1对：正向引物如SEQIDNO.1所示；反向引物如SEQIDNO.2所示；第2对：正向引物如SEQIDNO.3所示；反向引物如SEQIDNO.4所示；第3对：正向引物如SEQIDNO.5所示；反向引物如SEQIDNO.6所示；第4对：正向引物如SEQIDNO.7所示；反向引物如SEQIDNO.8所示；第5对：正向引物如SEQIDNO.9所示；反向引物如SEQIDNO.10所示；第6对：正向引物如SEQIDNO.11所示；反向引物如SEQIDNO.12所示；第7对：正向引物如SEQIDNO.13所示；反向引物如SEQIDNO.14所示；第8对：正向引物如SEQIDNO.15所示；反向引物如SEQIDNO.16所示；第9对：正向引物如SEQIDNO.17所示；反向引物如SEQIDNO.18所示；第10对：正向引物如SEQIDNO.19所示；反向引物如SEQIDNO.20所示；其中，第1、2、3、4、5对为一组，第6、7、8、9、10对为另一组；第1、3、5、6、8、10对引物5’端采用FAM荧光基团进行修饰；第2、4、7、9对引物5’端采用HEX荧光基团进行修饰；(3)微卫星位点基因分型及家系鉴定以步骤(2)中所述的10对微卫星位点引物采用多重PCR反应对亲本及子代的基因组DNA进行扩增，扩增按照步骤(2)中所选微卫星引物分组的方法进行，扩增产物在ABI3730XL遗传分析系统上进行毛细管电泳，用GS-500作为内参，用GeneMarkerv2.2.0软件读取每个样品的基因型，采用CERVUS3.0软件对亲本和子代基因型进行分析，判定子代个体的双亲。所述的斑点叉尾鮰微卫星家系鉴定方法步骤(1)具体方法优选：剪取用于构建家系的斑点叉尾鮰亲本和每个家系子代的鳍条组织，提取亲本和子代的基因组DNA，并检测质量和浓度。多重PCR扩增反应体系优选为：扩增条件优选：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃～51℃每个循环减1℃退火30s，72℃延伸60s，9个循环；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，15个循环；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸60s，15个循环；72℃延伸10min。用鉴定于斑点叉尾鮰微卫星家系的微卫星位点引物组合物，由以下10对微卫星位点引物组成：第1对：正向引物如SEQIDNO.1所示；反向引物如SEQIDNO.2所示；第2对：正向引物如SEQIDNO.3所示；反向引物如SEQIDNO.4所示；第3对：正向引物如SEQIDNO.5所示；反向引物如SEQIDNO.6所示；第4对：正向引物如SEQIDNO.7所示；反向引物如SEQIDNO.8所示；第5对：正向引物如SEQIDNO.9所示；反向引物如SEQIDNO.10所示；第6对：正向引物如SEQIDNO.11所示；反向引物如SEQIDNO.12所示；第7对：正向引物如SEQIDNO.13所示；反向引物如SEQIDNO.14所示；第8对：正向引物如SEQIDNO.15所示；反向引物如SEQIDNO.16所示；第9对：正向引物如SEQIDNO.17所示；反向引物如SEQIDNO.18所示；第10对：正向引物如SEQIDNO.19所示；反向引物如SEQIDNO.20所示；所述的引物组合物优选：第1、2、3、4、5对引物为一组，第6、7、8、9、10对引物为另一组；第1、3、5、6、8、10对引物的5’端采用FAM荧光基团进行修饰；第2、4、7、9对引物的5’端采用HEX荧光基团进行修饰。本专利技术所述的用鉴定于斑点叉尾鮰微卫星家系的微卫星位点引物组合物在混养斑点叉尾鮰的亲子鉴定中的应用。一种混养斑点叉尾鮰亲子鉴定试剂盒，包含本专利技术所述的引物组合物。本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术可将不同斑点叉尾鮰家系混养在同一池塘内，不需要采用物理隔离的方式将各家系子代养殖于水族箱或水泥池，可极大节省人力、物力和财力；(2)本专利技术将不同家系子代放在一起混养，可避免家系分开放养引入的环境误差，减少小水体养殖病害问题，极大地提高了选育效果；(3)采用本专利技术可以等到混养的斑点叉尾鮰子代长到较大规格后注射电子标记，降低电子标记注射后子代死亡率；(4)本专利技术中所选的10对微卫星引物建立的两组多重PCR扩增反应稳定、扩增片段清楚，毛细管电泳反应结束后易于判型，适用于斑点叉尾鮰的亲子鉴定。具体实施方式实施例1(1)斑点叉尾鮰核心选育家系的建立2008年使用1997～2004年从美国引进德克萨斯(1997)群体、阿肯色(1999)群体、密西西比(2001)群体、阿肯色(2003)群体和阿肯色(2004)群体共405尾斑点叉尾鮰建立育种基础群体，利用基础群体进行G0代家系构建。2011年6月选用G0代选育群体作为本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种斑点叉尾鮰微卫星家系鉴定方法，其特征在于包括如下步骤：(1)提取混养的亲本和子代斑点叉尾鮰的基因组DNA，并检测质量和浓度(2)多态性微卫星标记筛选和引物合成选取10个微卫星位点引物，按照PCR扩增片段大小分为2组，在正向引物的5’端分别用FAM、HEX两种不同的荧光基团进行修饰，用于多重PCR扩增；所述的10对微卫星位点引物的核苷酸序列分别为：第1对：正向引物如SEQ ID NO.1所示；反向引物如SEQ ID NO.2所示；第2对：正向引物如SEQ ID NO.3所示；反向引物如SEQ ID NO.4所示；第3对：正向引物如SEQ ID NO.5所示；反向引物如SEQ ID NO.6所示；第4对：正向引物如SEQ ID NO.7所示；反向引物如SEQ ID NO.8所示；第5对：正向引物如SEQ ID NO.9所示；反向引物如SEQ ID NO.10所示；第6对：正向引物如SEQ ID NO.11所示；反向引物如SEQ ID NO.12所示；第7对：正向引物如SEQ ID NO.13所示；反向引物如SEQ ID NO.14所示；第8对：正向引物如SEQ ID NO.15所示；反向引物如SEQ ID NO.16所示；第9对：正向引物如SEQ ID NO.17所示；反向引物如SEQ ID NO.18所示；第10对：正向引物如SEQ ID NO.19所示；反向引物如SEQ ID NO.20所示；其中，第1、2、3、4、5对为一组，第6、7、8、9、10对为另一组；第1、3、5、6、8、10对引物5’端采用FAM荧光基团进行修饰；第2、4、7、9对引物5’端采用HEX荧光基团进行修饰；(3)微卫星位点基因分型及家系鉴定以步骤(2)中所述的10对微卫星位点引物采用多重PCR反应对亲本及子代的基因组DNA进行扩增，扩增按照步骤(2)中所选微卫星引物分组的方法进行，扩增产物在ABI 3730XL遗传分析系统上进行毛细管电泳，用GS‑500作为内参，用GeneMarker v2.2.0软件读取每个样品的基因型，采用CERVUS 3.0软件对亲本和子代基因型进行分析，判定子代个体的双亲。...
【技术特征摘要】
1.一种斑点叉尾鮰微卫星家系鉴定方法，其特征在于包括如下步骤：(1)提取混养的亲本和子代斑点叉尾鮰的基因组DNA，并检测质量和浓度(2)多态性微卫星标记筛选和引物合成选取10个微卫星位点引物，按照PCR扩增片段大小分为2组，在正向引物的5’端分别用FAM、HEX两种不同的荧光基团进行修饰，用于多重PCR扩增；所述的10对微卫星位点引物的核苷酸序列分别为：第1对：正向引物如SEQIDNO.1所示；反向引物如SEQIDNO.2所示；第2对：正向引物如SEQIDNO.3所示；反向引物如SEQIDNO.4所示；第3对：正向引物如SEQIDNO.5所示；反向引物如SEQIDNO.6所示；第4对：正向引物如SEQIDNO.7所示；反向引物如SEQIDNO.8所示；第5对：正向引物如SEQIDNO.9所示；反向引物如SEQIDNO.10所示；第6对：正向引物如SEQIDNO.11所示；反向引物如SEQIDNO.12所示；第7对：正向引物如SEQIDNO.13所示；反向引物如SEQIDNO.14所示；第8对：正向引物如SEQIDNO.15所示；反向引物如SEQIDNO.16所示；第9对：正向引物如SEQIDNO.17所示；反向引物如SEQIDNO.18所示；第10对：正向引物如SEQIDNO.19所示；反向引物如SEQIDNO.20所示；其中，第1、2、3、4、5对为一组，第6、7、8、9、10对为另一组；第1、3、5、6、8、10对引物5’端采用FAM荧光基团进行修饰；第2、4、7、9对引物5’端采用HEX荧光基团进行修饰；(3)微卫星位点基因分型及家系鉴定以步骤(2)中所述的10对微卫星位点引物采用多重PCR反应对亲本及子代的基因组DNA进行扩增，扩增按照步骤(2)中所选微卫星引物分组的方法进行，扩增产物在ABI3730XL遗传分析系统上进行毛细管电泳，用GS-500作为内参，用GeneMarkerv2.2.0软件读取每个样品的基因型，采用CERVUS3.0软件对亲本和子代基因型进行分析，判定子代个体的双亲。2.根据权利要求1所述的斑点叉尾鮰微卫星家系鉴定方法，其特征在于步骤(1...
【专利技术属性】
技术研发人员：张世勇，陈校辉，王明华，边文冀，秦钦，钟立强，姜虎成，
申请(专利权)人：江苏省淡水水产研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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