一种肉葡萄球菌合成培养基及其发酵液的制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种肉葡萄球菌合成培养基及其发酵液的制备方法及应用。其中肉葡萄球菌(

【技术实现步骤摘要】
一种肉葡萄球菌合成培养基及其发酵液的制备方法与应用
本专利技术属于微生物培养基和发酵
，涉及一种肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)合成培养基及其发酵液的制备方法及应用。
技术介绍
葡萄球菌（Staphylococcus）为平均直径在0.5-1.0μm的革兰氏阳性菌，因其堆叠起来的形状类似葡萄串珠而得名，一般不具有致病性。代表种有表皮葡萄球菌（Staphylococcusepidermidis）、金黄色葡萄球菌（StaphyloccocusaureusRosenbach）和腐生葡萄球菌（Staphyloccocussaprophyticus）等。长期以来，人们将葡萄球菌用于干肠的发酵。起初，它们被认为是微球菌，但事实证明，这些微球菌被错误分类了，实际上是葡萄球菌。基于DNA/DNA杂交，生化特性和细胞壁组成，这些葡萄球菌形成了一种新的物种，命名为肉葡萄球菌（Staphylococcuscarnosus），其可以从肉类发酵产物中分离出来，并于1950年开始被用作发酵起始剂。肉葡萄球菌（S.carnosus）因为其不产生任何溶血素蛋白、毒素、凝固酶、蛋白质A或凝集因子，被世界公认为是食品级GRAS（generallyrecognizedsafe）葡萄球菌。肉葡萄球菌是肉制品发酵行业中形成肉制品风味的关键菌种，在欧洲等地被用作生肉产品起始培养物已经超过80年。在干香肠发酵成熟的过程中，肉葡萄球菌可先将硝酸盐还原为亚硝酸盐。这个反应的优点是硝酸盐的浓度降低，亚硝酸盐可与肌红蛋白（myoglobin,Mb）结合形成亚硝基血红蛋白（hemoglobin,Hb），使肉呈现典型的红色。然后亚硝酸盐进一步还原成氨，从而降低了未结合的亚硝酸盐浓度。在培养基和肉基质中，肉葡萄球菌均可将高铁肌红蛋白转化为红色肌红蛋白衍生物，使肉制品获得较好的色泽。肉葡萄球菌还产生能够水解蛋白质的酶，干香肠发酵过程中酶的分解产物能形成独特的风味。此外，其的胞外蛋白水解能力很低，因此可用做基因克隆技术的宿主菌，这样就可以研究这类菌的相关代谢途径和它们分泌和表达异源蛋白的情况。本研究所用菌种为肉葡萄球菌的重组菌：StaphylococcuscarnosusATCC51365/pBT2-ET-5R-EGFP，带有增强型绿色荧光蛋白的肉葡萄球菌，一方面提高菌种的生长状况，另一方面制备其发酵液。绿色荧光蛋白（GFP）在研究方面有很大的价值。EGFP是GFP突变系。目前应用较多的是GFP的突变体：增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)是在绿色荧光蛋白(GFP)的基础上经碱基修饰和人为改造而成的，其中第64位的苯丙氨酸(Phe)替换为亮氨酸(Leu)，第65位的丝氨酸(Ser)替换为苏氨酸(Thr)，发射出的荧光强度比GFP高6倍以上，因此，比GFP更适合作为一种报告基因来研究基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等。一直以来，培养肉葡萄球菌所用的复合培养基的成分复杂，碳源和氮源丰富，使用这种复合培养基进行发酵，虽然效价较高，但由于其中的酵母提取物成分复杂，不同产地、不同批次存在差异，影响了对实验结果进行定量和定性分析，且在分离蛋白时，杂蛋白的条带比较多，而且对于其他物质的分离纯化产生很大的影响。合成培养基的成分明确，通过对合成培养基组分的研究，确定影响菌种生长的主要因子，有利于对菌体生长、遗传育种与发酵代谢机制的研究，以及转录组学与代谢组学等方面的研究。
技术实现思路
本专利技术要解决的第一个技术问题是提供一种重组质粒pBT2-ET-5R-EGFP的构建方法。本专利技术要解决的第二个技术问题是提供一种肉葡萄球菌合成培养基。本专利技术要解决的第三个技术问题是提供一种肉葡萄球菌发酵液的制备方法。本专利技术要解决的第四个技术问题是提供一种肉葡萄球菌发酵液在提高肉葡萄球菌生长量方面的应用。具体描述如下：为解决上述第一个技术问题，本专利技术公开了一种重组质粒pBT2-ET-5R-EGFP的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：穿梭载体pBT2-ET-5R-EGFP：以pBT2质粒为骨架，在其KpnI和NheI克隆位点之间插入一个tat-egfp融合基因制备得到；该EGFP融合基因的启动子为肉葡萄球菌ATCC51365的eftu基因的启动子序列（GenBankAccessionNo:7551602），信号肽采用肉葡萄球菌ATCC51365的efeB基因的tat信号肽序列（GenBankAccessionNo:AM295250），并在后续的EGFP基因（GenBankAccessionNo:AF302837）的N-末端加入一个含有5个连续精氨酸序列（5R）的连接肽linker；其中从tat信号肽起始密码子到EGFP蛋白的碱基序列参照图5，其碱基序列如SEQIDNO.1所示，其氨基酸序列参照图6，如SEQIDNO.2所示。质粒pBT2-ET-5R-EGFP从tat信号肽到EGFP的碱基序列：ATGACACAAGACAAGCATGAAGGTAATGAAGTTTCACGTCGTTTTTTTCTGAAAATGTTAGGTATCGGCGGTGCAGGCGCAGTCATCGGTGCTAGTGGAGTCGGCGGCATTTTTTCTTTCAAGCTTCGTCGCCGTCGCCGTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAATGAGCTAGC质粒pBT2-ET-5R-EGFP从tat信号肽到EGFP的氨基酸序列：MTQDKHEGNEVSR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组质粒pBT2‑ET‑5R‑EGFP的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：穿梭载体pBT2‑ET‑5R‑EGFP：以pBT2质粒为骨架，在其

【技术特征摘要】
1.一种重组质粒pBT2-ET-5R-EGFP的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：穿梭载体pBT2-ET-5R-EGFP：以pBT2质粒为骨架，在其KpnI和NheI克隆位点之间插入一个tat-egfp融合基因制备得到；该EGFP融合基因的启动子为肉葡萄球菌ATCC51365的eftu基因的启动子序列（GenBankAccessionNo:7551602），信号肽采用肉葡萄球菌ATCC51365的efeB基因的tat信号肽序列（GenBankAccessionNo:AM295250），并在后续的EGFP基因（GenBankAccessionNo:AF302837）的N-末端加入一个含有5个连续精氨酸序列（5R）的链接肽linker；其中从tat信号肽起始密码子到EGFP蛋白的碱基序列参照图5，其碱基序列如SEQIDNO.1所示，氨基酸序列参照图6，如SEQIDNO.2所示。2.一种肉葡萄球菌合成培养基，其特征在于，按1L体积计算，是由如下重量的原料组成：无水葡萄糖10~50g，赖氨酸0.1~1.5g，缬氨酸1.0~5.0g，甘氨酸0.1~1.5g，精氨酸1.0~5.0g，脯氨酸1.0~5.0g，谷氨酸5~10.0g，胱氨酸0.1~1.5g色氨酸0.1~0.5g，盐酸硫胺素1.0~3.0mg，泛酸钙1.0~3.0mg，烟酸1.0~3.0mg，硫酸锰1.0~3.0mg，磷酸二氢钾0.1~1.0g，七水硫酸镁0.1~0.8g，七水硫酸亚铁0.005~0.010g，三水磷酸氢二钾1.0~5.0g，3-(N-吗啉)丙磺酸6~10g，剩余为水。3.根据权利要求2所述的肉葡萄球菌合成培养基，其特征在于：所述肉葡萄球菌合成培养基的pH=6.5~8.0。4.根据权利要求2所述的肉葡萄球菌合成培养基，其特征在于：无水葡萄糖40g，赖氨酸1.0g，缬氨酸3.0g，甘氨酸1.0g，精氨酸2.0g，脯氨酸2.0g，谷氨酸7.0g，色氨酸0.4g，胱氨酸1.0g，泛酸钙2mg，烟酸2mg，盐酸硫胺素2mg，硫酸锰2mg，磷酸二氢钾0.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：高强，唐巧巧，张变强，朱燕，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12