一种EpCAM抗体免疫磁珠的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种EpCAM抗体免疫磁珠的制备方法，具体步骤如下：合成油酸‑Fe3O4；Fe3O4/PVAc磁性微球制备；(Fe3O4/PVA)/SiO2磁性微球的制备；将氨基化的磁性纳米颗粒加入到戊二醛的PBS溶液中，搅拌3h，通过氨基与醛基之间形成的Schiff碱在磁性颗粒表面修饰上醛基官能团，反应结束后利用外加磁场从反应介质中分离出颗粒，将颗粒分散在PBS溶液中；抗体的肼基化修饰：将含对‑丙腙基吡啶甲酸N‑羟基琥珀酰亚胺脂的二甲基甲酰胺溶液加入到EpCAM抗体溶液中，反应2h后，用超滤柱纯化得到肼基修饰的EpCAM抗体；免疫磁珠的制备：将醛基修饰的磁性微球与肼基修饰的EpCAM抗体混合，混合,得到EpCAM抗体偶联磁性微球的EpCAM抗体免疫磁珠。本发明专利技术具有稳定性好、特异性强等优点。

A preparation method of EpCAM antibody immunomagnetic beads

The invention discloses a method for preparing EpCAM antibody immunomagnetic beads, the specific steps are as follows: the synthesis of oleic acid Fe3O4 Fe3O4/PVAc; magnetic microspheres; (Fe3O4/PVA) /SiO2 magnetic microspheres; magnetic nanoparticles aminatel added to the PBS solution of glutaraldehyde, stirring 3h, formed by amino and aldehyde the Schiff base on the surface modification of magnetic particles, aldehyde, after the reaction with magnetic field separating particles from the reaction medium, the particles dispersed in PBS solution; hydrazine modified antibody: containing two methyl formamide solution of propylene hydrazone group picolinic acid N hydroxysuccinimide ester added to EpCAM antibody solution, reaction 2h, EpCAM antibody was purified by hydrazide modified ultrafiltration column; immunomagnetic beads preparation: aldehyde modified magnetic microspheres and the hydrazide modified EpCAM resistance The body was mixed and mixed to obtain the EpCAM antibody immunomagnetic beads of the EpCAM antibody coupling magnetic microspheres. The invention has the advantages of good stability, strong specificity and the like.

【技术实现步骤摘要】
一种EpCAM抗体免疫磁珠的制备方法
本专利技术涉及免疫磁珠制备领域，具体来说是一种EpCAM抗体免疫磁珠的制备方法。
技术介绍
免疫磁珠分离技术(IMB)是近年来国内外研究较多的一种新的免疫学技术。目前该项技术在细胞分离、蛋白质纯化、免疫学及微生物学检测等方面取得了较大进展。该分离方法具有灵敏度高、检测速度快、特异性高等优点。但是我国市场上所应用的磁珠一般是国外进口而来，价格昂贵，因此极大限制了免疫磁珠在我国医学、科研等方面的应用。磁性纳米微粒的制备方法目前有多种，包括物理法、化学法及其他一些特殊的制备方法。化学沉淀法是应用最多的方法。化学沉淀法主要分两种，第一种是化学共沉淀法，指二价与三价铁离子在碱性条件下生成沉淀，或利用氧化还原反应生成Fe3O4.其原理方程式为：Fe2++2Fe3++8OH-＝Fe3O4+4H2O，在合成过程中，条件的选择至关重要，物料比，碱用量，温度，净化温度，搅拌速度，反应时间等因素都会影响最终产物纳米级Fe3O4的生成和性质。共沉淀法得到的磁性微粒通常粒径较小，在10nm-100nm之间，因而具有较大的比表面积和固载量。第二种是氧化沉淀法，一定浓度的铁盐在碱性条件下生成氢氧化亚铁沉淀，在恒温搅拌情况下，向氢氧化亚铁沉淀中加入双氧水使其氧化成Fe3O4微粒。反应方程式为：Fe2++2OH-＝Fe(OH)2，3Fe(OH)2+O＝Fe3O4+3H2O。这种方法制得的磁性颗粒原材料的纯度，反应的碱比，温度，通气量，氧化时间等因素都对磁粒的性能有影响。由于存在着粒度分布不均的问题，还有待进一步研究解决。上皮细胞黏附分子(EpCAM)为一种跨膜糖蛋白,表达于上皮组织和多数上皮源性恶性肿瘤中,与细胞的黏附、迁移、增生、分化以及肿瘤的发生、进展等有关。近年来，EpCAM被认为是肿瘤的干细胞标记，与其诊断、治疗及预后判定相关。以EpCAM阳性循环肿瘤细胞为基础的检测技术也被逐步开发应用。目前，EpCAM抗体主要应用于上皮源性恶性肿瘤的研究等方面，但仍有待于进一步研究和探讨。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有技术中的稳定性差、特异性不好的缺陷，而提供一种EpCAM抗体免疫磁珠的制备方法。本专利技术解决上述技术问题提供的技术方案是：本专利技术公开了一种EpCAM抗体免疫磁珠的制备方法，具体步骤如下：一、合成油酸-Fe3O4：(1.1)、在通氮气的条件下，将FeSO4·7H2O、FeCl3·6H2O溶解于800ml蒸馏水中，加热回流，加热至90℃时，在搅拌的同时，将30ml氨水加入以上溶液中；(1.2)、加入20ml油酸，90℃下持续搅拌1小时后停止反应；(1.3)、待溶液冷却至室温后,外加磁场吸附出沉淀，然后用蒸馏水清洗至少一次，产物即为油酸-Fe3O4；二、Fe3O4/PVAc磁性微球制备：(2.1)、向安装有搅拌器、冷凝管、温度计及导气管的四口烧瓶中加入100ml水，水浴加热回流，通入氮气脱气20min；(2.2)、加入表面活性剂和助表面活性剂，搅拌使充分混匀；(2.3)、加入10ml含有0.4g油酸-Fe3O4纳米颗粒的醋酸乙烯酯混合溶液，搅拌使充分混匀；(2.4)、加热，温度均匀上升，在45-60℃的范围内停留30-120min，当反应体系温度升高到80℃，加入过氧化苯甲酰0.5g，恒温反应8h，随着反应的进行，液体颜色由黑色变为红棕色；(2.5)、反应结束后，利用外加磁场将Fe3O4/PVAc从溶液中分离出来，用无水乙醇溶液清洗3次；三、(Fe3O4/PVA)/SiO2磁性微球的制备：(3.1)、将以上所得颗粒分散在200ml乙醇和水中，将以上混合溶液超声10min，使其均匀分散；(3.2)、根据选择生成的SiO2壳的厚度，向溶液中加入正硅酸乙酯，然后搅拌30min；(3.3)、加入0.5ml氨水溶液，室温下搅拌1-4h，利用外加磁场将终产物分离，再用乙醇清洗三次后，再分散在无水乙醇中，制备得到含(Fe3O4/PVA)/SiO2磁性微球的乙醇悬浮液；四、磁性颗粒的氨基化修饰：将0.4ml3-氨丙基三乙氧基硅烷滴加到含(Fe3O4/PVA)/SiO2磁性微球的乙醇悬浮液中，室温下搅拌7h氨基化，利用外加磁场从反应介质中分离出，并用乙醇溶液对其清洗五次备用；五、磁性颗粒的醛基化修饰：将氨基化的磁性纳米颗粒加入到50ml3％戊二醛的PBS溶液中，37℃下搅拌3h，通过氨基与醛基之间形成的Schiff碱在磁性颗粒表面修饰上醛基官能团，反应结束后利用外加磁场从反应介质中分离出颗粒，用PBS溶液反复冲洗产物，将颗粒分散在PBS溶液中，最终浓度为8μg/μl；六、抗体的肼基化修饰：将5μL含对-丙腙基吡啶甲酸N-羟基琥珀酰亚胺脂的二甲基甲酰胺溶液加入到100μLEpCAM抗体溶液中，室温反应2h后，用超滤柱纯化得到肼基修饰的EpCAM抗体；七、免疫磁珠的制备：将醛基修饰的磁性微球与肼基修饰的EpCAM抗体混合，在4-25℃下PH值6.0的PBS缓冲液中混合2h-24h,在磁分离作用下得到EpCAM抗体偶联磁性微球的EpCAM抗体免疫磁珠。作为优选，所述的步骤(1.1)中，FeSO4·7H2O与FeCl3·6H2O的摩尔比为1:2。作为优选，所述的步骤(2.2)中，所述的表面活性剂为十六烷基三甲氧基溴化铵，所述的助表面活性剂采用正丁醇。作为优选，所述的步骤(2.2)中，所述的十六烷基三甲氧基溴化铵为0.3g，所述的正丁醇为3ml。作为优选，所述的步骤(3.1)中，所述的乙醇和水的比例为4:1。作为优选，所述的步骤(3.2)中，所述的正硅酸乙酯加入量为1.0ml，SiO2壳的厚度为200nm级。作为优选，所述的步骤(1.1)和步骤(3.3)中，所述的氨水的质量浓度为25-28％。作为优选，所述的步骤六中，所述的二甲基甲酰胺溶液中的对-丙腙基吡啶甲酸N-羟基琥珀酰亚胺脂浓度为5mmol/L，所述的EpCAM抗体溶液的浓度为10μmol/L。作为优选，所述的步骤六中，抗体的肼基化修饰中，对-丙腙基吡啶甲酸N-羟基琥珀酰亚胺脂的摩尔当量可为抗体EpCAM的10-50倍。作为优选，所述的步骤七中，所述的醛基修饰的磁性微球与肼基修饰的EpCAM抗体质量比为1:0.01-1。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益优点：本专利技术采用共沉淀法制备Fe3O4纳米颗粒，即将一定比例的铁盐与亚铁盐混合滴加到碱性溶液中，反应得到，且本专利技术选用FeSO4·7H2O、FeCl3·6H2O(摩尔比为1:2)，得到的粒子为圆形且大小均一，此法操作简便；Fe3O4/PVAc磁性微球制备过程中添加了表面活性剂和助表面活性剂，分别为CTAB(十六烷基三甲氧基溴化铵)和正丁醇，这可以增强磁微粒的稳定性，CTAB：0.3g，正丁醇：3ml；本专利技术利用微乳液合成法产生二氧化硅包埋磁性颗粒，可以为磁性表面提供羟基官能团，方便与硅烷偶联剂的反应；(Fe3O4/PVA)/SiO2磁性微球的制备过程中，可通过加入不同量的TEOS(正硅酸乙酯)来选择生成的SiO2壳的厚度；综上，本专利技术的有益之处在于操作简便，成本低，所得免疫磁珠分散性优，特异性好，稳定性好，白细胞获取率高，具有超顺磁性。附图说明图1为实施例1中EpCAM抗体免疫磁珠捕获的循本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种EpCAM抗体免疫磁珠的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：一、合成油酸‑Fe3O4：(1.1)、在通氮气的条件下，将FeSO4·7H2O、FeCl3·6H2O溶解于800ml蒸馏水中，加热回流，加热至90℃时，在搅拌的同时，将30ml氨水加入以上溶液中；(1.2)、加入20ml油酸，90℃下持续搅拌1小时后停止反应；(1.3)、待溶液冷却至室温后,外加磁场吸附出沉淀，然后用蒸馏水清洗至少一次，产物即为油酸‑Fe3O4；二、Fe3O4/PVAc磁性微球制备：(2.1)、向安装有搅拌器、冷凝管、温度计及导气管的四口烧瓶中加入100ml水，水浴加热回流，通入氮气脱气20min；(2.2)、加入表面活性剂和助表面活性剂，搅拌使充分混匀；(2.3)、加入10ml含有0.4g油酸‑Fe3O4纳米颗粒的醋酸乙烯酯混合溶液，搅拌使充分混匀；(2.4)、加热，温度均匀上升，在45‑60℃的范围内停留30‑120min，当反应体系温度升高到80℃，加入过氧化苯甲酰0.5g，恒温反应8h，随着反应的进行，液体颜色由黑色变为红棕色；(2.5)、反应结束后，利用外加磁场将Fe3O4/PVAc从溶液中分离出来，用无水乙醇溶液清洗3次；三、(Fe3O4/PVA)/SiO2磁性微球的制备：(3.1)、将以上所得颗粒分散在200ml乙醇和水中，将以上混合溶液超声10min，使其均匀分散；(3.2)、根据选择生成的SiO2壳的厚度，向溶液中加入正硅酸乙酯，然后搅拌30min；(3.3)、加入0.5ml氨水溶液，室温下搅拌1‑4h，利用外加磁场将终产物分离，再用乙醇清洗三次后，再分散在无水乙醇中，制备得到含(Fe3O4/PVA)/SiO2磁性微球的乙醇悬浮液；四、磁性颗粒的氨基化修饰：将0.4ml 3‑氨丙基三乙氧基硅烷滴加到含(Fe3O4/PVA)/SiO2磁性微球的乙醇悬浮液中，室温下搅拌7h氨基化，利用外加磁场从反应介质中分离出，并用乙醇溶液对其清洗五次备用；五、磁性颗粒的醛基化修饰：将氨基化的磁性纳米颗粒加入到50ml3％戊二醛的PBS溶液中，37℃下搅拌3h，通过氨基与醛基之间形成的Schiff碱在磁性颗粒表面修饰上醛基官能团，反应结束后利用外加磁场从反应介质中分离出颗粒，用PBS溶液反复冲洗产物，将颗粒分散在PBS溶液中，最终浓度为8μg/μl；六、抗体的肼基化修饰：将5μL含对‑丙腙基吡啶甲酸N‑羟基琥珀酰亚胺脂的二甲基甲酰胺溶液加入到100μLEpCAM抗体溶液中，室温反应2h后，用超滤柱纯化得到肼基修饰的EpCAM抗体；七、免疫磁珠的制备：将醛基修饰的磁性微球与肼基修饰的EpCAM抗体混合，在4‑25℃下PH值6.0的PBS缓冲液中混合2h‑24h,在磁分离作用下得到EpCAM抗体偶联磁性微球的EpCAM抗体免疫磁珠。...

【技术特征摘要】
1.一种EpCAM抗体免疫磁珠的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：一、合成油酸-Fe3O4：(1.1)、在通氮气的条件下，将FeSO4·7H2O、FeCl3·6H2O溶解于800ml蒸馏水中，加热回流，加热至90℃时，在搅拌的同时，将30ml氨水加入以上溶液中；(1.2)、加入20ml油酸，90℃下持续搅拌1小时后停止反应；(1.3)、待溶液冷却至室温后,外加磁场吸附出沉淀，然后用蒸馏水清洗至少一次，产物即为油酸-Fe3O4；二、Fe3O4/PVAc磁性微球制备：(2.1)、向安装有搅拌器、冷凝管、温度计及导气管的四口烧瓶中加入100ml水，水浴加热回流，通入氮气脱气20min；(2.2)、加入表面活性剂和助表面活性剂，搅拌使充分混匀；(2.3)、加入10ml含有0.4g油酸-Fe3O4纳米颗粒的醋酸乙烯酯混合溶液，搅拌使充分混匀；(2.4)、加热，温度均匀上升，在45-60℃的范围内停留30-120min，当反应体系温度升高到80℃，加入过氧化苯甲酰0.5g，恒温反应8h，随着反应的进行，液体颜色由黑色变为红棕色；(2.5)、反应结束后，利用外加磁场将Fe3O4/PVAc从溶液中分离出来，用无水乙醇溶液清洗3次；三、(Fe3O4/PVA)/SiO2磁性微球的制备：(3.1)、将以上所得颗粒分散在200ml乙醇和水中，将以上混合溶液超声10min，使其均匀分散；(3.2)、根据选择生成的SiO2壳的厚度，向溶液中加入正硅酸乙酯，然后搅拌30min；(3.3)、加入0.5ml氨水溶液，室温下搅拌1-4h，利用外加磁场将终产物分离，再用乙醇清洗三次后，再分散在无水乙醇中，制备得到含(Fe3O4/PVA)/SiO2磁性微球的乙醇悬浮液；四、磁性颗粒的氨基化修饰：将0.4ml3-氨丙基三乙氧基硅烷滴加到含(Fe3O4/PVA)/SiO2磁性微球的乙醇悬浮液中，室温下搅拌7h氨基化，利用外加磁场从反应介质中分离出，并用乙醇溶液对其清洗五次备用；五、磁性颗粒的醛基化修饰：将氨基化的磁性纳米颗粒加入到50ml3％戊二醛的PBS溶液中，37℃下搅拌3h，通过氨基与醛基之间形成的Schiff碱在磁性颗粒表面修饰上醛基官能团，反应结束后利用外加磁场从反应介质中分离出颗粒，用PBS溶液反复冲洗产物，将颗粒分散在PBS溶液中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦玉军，李航，陆宝石，苏军，吴远航，
申请(专利权)人：安徽安龙基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34