一种用于我国对虾虾肝肠孢虫检测的荧光检测试剂盒制造技术

一种用于我国对虾虾肝肠孢虫检测的荧光检测试剂盒，涉及对虾疾病检测。设有组织裂解液、恒温荧光法反应液、阳性对照品和阴性对照品。虾组织DNA的提取；虾肝肠孢子虫恒温荧光扩增；虾肝肠孢子虫恒温荧光检测结果判定。利用所述的通过恒温荧光法进行EHP检测的荧光检测试剂盒，阳性样品经恒温荧光扩增仪扩增后可见线性良好的扩增曲线，并且具有更高的扩增速率；灵敏度实验结果表明，荧光检测试剂盒具有更高的灵敏度，可用于定量实验。针对虾肝肠孢子虫基因组DNA设计开发了特异性强、灵敏度高、扩增效率高的恒温荧光引物，相对于普通LAMP引物增加了环引物，达到扩增效率更高，检测速度更快。

For our country to detect Jacques hepatoenteral fluorescence spore insect detection kit

For our country to detect Jacques hepatoenteral fluorescence spore insect detection kit, relates to shrimp disease detection. There is a tissue lysate, a thermostatic reaction liquid, a positive control product and a negative control product. Extraction of shrimp tissue DNA; shrimp enterohepatic Cryptosporidium constant temperature fluorescence amplification; hepatoenteral shrimp Cryptosporidium fluorescence detection results to determine the temperature. The use of the kit for fluorescence detection of EHP detection by constant temperature fluorescence method, the positive samples by the constant fluorescent amplified amplified visible linear good amplification curve, and has a higher amplification rate; sensitivity test results show that the fluorescence detection kit has higher sensitivity, and can be used for quantitative experiments. According to the hepatoenteral Cryptosporidium genomic DNA shrimp developed strong specificity and high sensitivity and high efficiency fluorescent primer amplification constant, compared with the common LAMP primers added loop primers, achieve high amplification efficiency, faster detection.

【技术实现步骤摘要】
一种用于我国对虾虾肝肠孢虫检测的荧光检测试剂盒
本专利技术涉及对虾疾病检测，尤其是涉及一种用于我国对虾虾肝肠孢虫检测的荧光检测试剂盒。
技术介绍
微孢子虫(microsporidia)是一种真核、单细胞的专性细胞内寄生虫，广泛寄生于无脊椎动物和脊椎动物体内，是一些昆虫、水产动物以及哺乳动物的重要病原。虾肝肠微孢子虫(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)是微孢子虫的一个新物种，最早在泰国养殖的生长缓慢的斑节对虾(Penaeusmonodon)中发现，而后在凡纳滨对虾、脊尾白虾和中国对虾等中都有报道。这类微孢子虫主要感染对虾的肝胰腺从而破坏组织吸引营养的能力，虽不像WSSV、YHV、AHPND等会引起对虾大量死亡，但导致对虾生长缓慢的问题给对虾养殖业带来了巨大损失。在全世界范围内传播，特别是在亚洲的中国、马来西亚、越南、印度尼西亚、泰国，已经成为重灾区，与此同时，印度和墨西哥也先后发现了EHP。我国的养殖对虾中均有发现，EHP为胞内寄生虫，属于微孢子虫科、肠孢虫属，在宿主肝胰腺小管上皮细胞的细胞质内进行复制。国内外学者对微孢子虫的检测方法进行了大量的研究和探索，利用各种技术方法建立了一系列微孢子虫检测方法。传统染色镜检法是用染色剂对微孢子虫染色，通过颜色不同来区分是否是微孢子虫，该方法受到微孢子虫个体大小的限制，有些个体微小的微孢子虫如斑节对虾肝胰腺中的微孢子虫孢子大小为1μm左右，很难在显微镜下观察到([1]TourtipSomjintana,WongtripopSomjai,StentifordGrantD.etal.Enterocytozoonhepatopenaeisp.nov.(Microsporida:Enterocytozoonidae),aparasiteoftheblacktigershrimpPenaeusmonodon(Decapoda:Penaeidae):Finestructureandphylogeneticrelationships[J].JournalofInvertebratePathology,2009,102(1):21-29.)。免疫学检测技术主要是应用抗原抗体的特异结合在临床上检测不同种类的微孢子虫，包括家蚕微粒子虫、比氏肠微孢子虫、兔肠脑炎微孢子虫等，但灵敏度不高且存在假阳性结果。现代分子生物学检测技术主要包括常规PCR检测技术、实时荧光定量PCR、环介导核酸等温扩增以及基因芯片检测技术等，在病原检测领域发挥着重要的作用。分子检测方法极大地提高了检测灵敏度和特异性，比如对美洲鳊鱼组织中微孢子虫的检测可以达到10个以下的基因组拷贝数([2]PhelpsN.B.,GoodwinAndrewE.ValidationofaquantitativePCRdiagnosticmethodfordetectionofthemicrosporidianOvipleistophoraovariaeinthecyprinidfishNotemigonuscrysoleucas.[J].Diseasesofaquaticorganisms,2007,76(3):215-221)。在分子生物学检测技术中，环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)技术是一种新型等温核酸扩增方法，主要利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，并利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(BstDNAploymerase)，在恒温条件(65℃左右)下快速扩增核酸，保证了扩增的高特异性和高效率，在1h内能达到109～1010靶序列拷贝。LAMP方法具有操作简单、检测快速、灵敏度和特异性高且成本低廉等优点，已在核酸研究、疾病诊断、病原检测等领域得到广泛应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有检测方法在养殖病害监测中检测时间长、工作量大、主观性强等问题，提供灵敏度高、特异性强、操作简便、检测时间短、适合虾肝肠孢子虫病预防与筛查的一种用于我国对虾虾肝肠孢虫检测的荧光检测试剂盒。本专利技术所述用于我国对虾虾肝肠孢虫检测的荧光检测试剂盒设有组织裂解液、恒温荧光法反应液、阳性对照品和阴性对照品；所述组织裂解液的组成组分为：100mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0)，1％SDS，余量为水；所述恒温荧光法反应液的各组分组成为：引物EHP-OF0.2μM，引物EHP-OB0.2μM，引物EHP-IF1.6μM，引物EHP-IB1.6μM，引物EHP-LF0.8μM，引物EHP-LB0.8μM，Tris-HCl20mM(pH8.4～8.6)，KCl10mM，(NH4)2SO410mM，MgSO42mM，TritonX-1000.1％，BstDNAPolymeraseLargeFragment8U，SYTO-94μM，余量为水；引物EHP-OF：AGGTGGGCAAAGAATGAAAT；引物EHP-OB：AAGCAGCACAATCCACTC；引物EHP-IF：CCCAGCATTGTCGGCATAGTATCAAGGACGAAGGCTAGA；引物EHP-IB：TGTTGCGAGAGCGATGCTCCTTGCGAGCGTACTATC；引物EHP-LF：AGAACTACAGCGGTGTCTAATC；引物EHP-LB：TGGTGTGGGAGAAATCTTAGTT；所述阳性对照品为带有虾肝肠孢子虫基因的质粒；所述阴性对照品为无核酸的超纯水。所述用于我国对虾虾肝肠孢虫检测的荧光检测试剂盒的使用方法如下：1)虾组织DNA的提取；在步骤1)中，所述虾组织DNA的提取的具体方法可为：取50mg～1g的虾肝胰腺或肠与2倍体积的组织裂解液混合后匀浆，室温静置5min，95℃热浴10min；2)虾肝肠孢子虫恒温荧光扩增；在步骤2)中，所述虾肝肠孢子虫恒温荧光扩增的具体方法可为：(1)根据待检样品数，取n+2个荧光PCR管，分别加入23μl恒温荧光法反应液，所述待检样品数可包括待检样品n个、阴性对照1个、阳性对照1个，其中n的个数不限，可根据需要确定，一般可采用n为1～14；(2)在荧光PCR管中依次加入2μl各待检样品DNA、2μl阳性对照品和2μl阴性对照品；(3)标记清楚后将荧光PCR管放入恒温荧光检测仪中运行监测程序。3)虾肝肠孢子虫恒温荧光检测结果判定。在步骤3)中，所述虾肝肠孢子虫恒温荧光检测结果判定的具体方法可为：当扩增结束后，若阳性对照孔出现典型的S型扩增曲线，且阴性对照孔是平滑的直线，表明试验成立。待检样品孔若出现S型扩增曲线，表示该样品检测结果为阳性；待检样品孔若出现平滑的直线，表示该样品检测结果为阴性。对于传统的LAMP方法，有几种方法用来检测LAMP反应的产物。第一种是目测法：等温扩增过程中产生大量的副产物焦磷酸镁白色沉淀，把混浊度作为反映的指标，可以用肉眼直接观察结果；第二种是浊度计检测：反应的副产物焦磷酸镁白色沉淀和反应产物的量成一定的比例关系，通过实时浊度计检测产物的浊度变化，进行实时定量分析；第三种是电泳检测：LAMP法的扩增产物是各种不同长度的茎-环结构，通过琼脂糖电泳检测成梯形状条带；第四种是染料法：等本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于我国对虾虾肝肠孢虫检测的荧光检测试剂盒，其特征在于设有组织裂解液、恒温荧光法反应液、阳性对照品和阴性对照品。

【技术特征摘要】
1.一种用于我国对虾虾肝肠孢虫检测的荧光检测试剂盒，其特征在于设有组织裂解液、恒温荧光法反应液、阳性对照品和阴性对照品。2.如权利要求1所述一种用于我国对虾虾肝肠孢虫检测的荧光检测试剂盒，其特征在于所述组织裂解液的组成组分为：100mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0)，1％SDS，余量为水。3.如权利要求1所述一种用于我国对虾虾肝肠孢虫检测的荧光检测试剂盒，其特征在于所述恒温荧光法反应液的各组分组成为：引物EHP-OF0.2μM，引物EHP-OB0.2μM，引物EHP-IF1.6μM，引物EHP-IB1.6μM，引物EHP-LF0.8μM，引物EHP-LB0.8μM，Tris-HCl20mM(pH8.4～8.6)，KCl10mM，(NH4)2SO410mM，MgSO42mM，TritonX-1000.1％，BstDNAPolymeraseLargeFragment8U，SYTO-94μM，余量为水；引物EHP-OF：AGGTGGGCAAAGAATGAAAT；引物EHP-OB：AAGCAGCACAATCCACTC；引物EHP-IF：CCCAGCATTGTCGGCATAGTATCAAGGACGAAGGCTAGA；引物EHP-IB：TGTTGCGAGAGCGATGCTCCTTGCGAGCGTACTATC；引物EHP-LF：AGAACTACAGCGGTGTCTAATC；引物EHP-LB：TGGTGTGGGAGAAATCTTAGTT。4.如权利要求1所述一种用于我国对虾虾肝肠孢虫检...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐淑菲，谢会，孔繁德，罗达圣，陈信忠，高美玲，张璜，
申请(专利权)人：厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心，广州双螺旋基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35