本发明专利技术提供一株携带EB病毒潜伏膜抗原2基因的重组痘苗病毒及其应用，所述重组病毒的制备方法为：构建携带EBV LMP2、绿色荧光蛋白外源基因的重组质粒与MVA共同感染BHK‑21细胞，通过同源重组获得只携带EBV LMP2外源基因的MVA重组病毒(MVA‑LMP2A)。IFN‑γ免疫斑点法检测MVA‑LMP2A免疫过的小鼠脾淋巴细胞，表明MVA‑LMP2A可以很好的诱导小鼠体内产生EBV LMP2特异性免疫应答。
A strain of recombinant vaccinia virus carrying EB virus latent membrane protein 2 gene and its application
The invention provides a strain carrying the EB virus latent membrane protein 2 gene recombinant vaccinia virus and its application, the preparation method is as follows: to construct recombinant virus recombinant plasmid carrying EBV LMP2 and MVA, green fluorescent protein gene BHK co infected 21 cells, only carrying EBV LMP2 gene recombinant MVA the virus by homologous recombination (MVA LMP2A). Detection of MVA LMP2A mice spleen lymphocyte immune IFN gamma Dot-ELISA in the show that MVA LMP2A can induce the mice generated a good EBV LMP2 specific immune response.
【技术实现步骤摘要】
一株携带EB病毒潜伏膜抗原2基因的重组痘苗病毒及其应用
本专利技术涉及动物疫苗领域，具体涉及仅一种携带EBVLMP2外源基因的MVA-LMP2A重组病毒及其应用。专利技术背景Epstein-Barr病毒(EBV)属于疱疹病毒γ亚科，大多数初次感染为儿童时期，无明显临床症状，且终身携带。EBV在人类中广泛传播，与许多人类的肿瘤相关，包括Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌NPC、何杰金病HD和多种免疫抑制患者和移植患者的淋巴细胞增生紊乱引起的淋巴瘤(PTLD)等疾病[1]。因此该病毒的存在为基于CTL的肿瘤治疗提供了一个重要的潜在靶位。EBV表达的潜伏膜蛋白LMP1、LMP2发挥多重致瘤作用，可通过激活多重信号转导以及调控各种致瘤基因的表达发挥作用[2]。其中LMP2可以诱发较强的CD8+CTL，且一些抗原表位已经确定，EBV携带者体内的LMP2细胞免疫水平的高低与NPC的发生相关[3]。因此,目前许多EBV相关肿瘤治疗研究都是针对LMP2。LMP2是第8个被确认的潜伏膜蛋白，具有持续表达，不引起B淋巴细胞转化，无致癌性的特点，可以很好的可以诱发CTL反应磷酸化。此外，相关研究结果表明，该基因表达的蛋白，在患者体内可以很好的诱导特异性细胞免疫应答，而细胞免疫在抗肿瘤治疗中发挥重要作用。因此，可以利用LMP2作为体内诱导EBV特异性CTL、预防和治疗NPC的良好靶抗原。改良型的痘苗病毒安卡拉株(ModifiedvacciniavirusAnkara，MVA)是德国教授Mayr的科研团队在Ankara地区分离得到的痘病毒CVA株，在鸡胚成纤维细胞上百代的传代培养后，获得的致弱病毒株。传代过程中由于大约30Kb基因的丢失，使该病的宿主范围与致病性大大降低，从而使得MVA成为目前应用最为广泛、免疫原性好、安全、高效的表达载体之一。近年来利用基因重组以MVA为载体构建的疫苗已经被广泛应用到多种传染病以及肿瘤的疫苗研究中。2014年，携带EBV相关抗原的重组MVA，临床Ⅰ期试验结果显示，该疫苗具有良好的安全性和免疫原性，14位病人中有8位产生免疫反应，且诱导了特异性T细胞免疫应答，已进入临床Ⅱ期试验[4]。上述疫苗虽然进行了Ⅰ期临床实验，但是目前没有任何基础实验数据及相关的文献支持，本次实验对MVA-LMP2A疫苗株的构建及免疫学效果研究进行了探讨。EBNA1是EBV重要的致细胞转化的蛋白，而LMP2基因不引起B淋巴细胞的转化、无致癌性，是一个很好的可以引发CTL反应的蛋白，已成为免疫治疗NPC的良好靶抗原，所以本次实验从疫苗株安全等方面考虑，仅选用了LMP2抗原。本研究构建的MVA-LMP2A重组病毒，以MVA作为载体，只包含EBVLMP2外源基因，此外不携带任何外源基因，可以作为EBV相关肿瘤治疗疫苗研究及应用奠定了基础。参考文献：[1]左建民,周玲,曾毅.EB病毒潜伏膜蛋白2的研究回顾.中华实验和临床病毒学杂志,2003,Vol17:296-298.[2]Li,J.,Liu,X.,Liu,M,eta.MethylationandexpressionofEpstein–Barrviruslatentmembraneprotein1,2Aand2BinEBV-associatedgastriccarcinomasandcelllines.DigestiveandLiverDisease,Vol.48(6):673-680,2016.[3]周玲,姚庆云,LeeS.鼻咽癌患者和正常人群中EB病毒特异性T细胞对靶抗原的识别和应答.病毒学报,2001,Vol.17:7-10.[4]Njuguna,I.N.,Ambler,G.,Reilly,M.，etal.PedVacc002:AphaseI/IIrandomizedclinicaltrialofMVA.HIVAvaccineadministeredtoinfantsborntohumanimmunodeficiencyvirustype1-positivemothersinNairobi.Vaccine,Vol.32(44):5801-5808,2014.
技术实现思路
基于本实验室以EBVLMP2作为靶点的相关重组疫苗研制的基础背景，构建携带EBVLMP2、绿色荧光蛋白(GFP)外源基因的重组质粒(PZL-GFP-LMP2)与MVA共同感染BHK-21细胞，通过同源重组获得同时携带外源基因EBVLMP2与GFP的MVA重组病毒(MVA-GFP-LMP2A)。获得的MVA-GFP-LMP2A通过自身同源重组脱掉GFP基因，经过几轮筛选、鉴定获得只携带EBVLMP2外源基因的MVA重组病毒(MVA-LMP2A)。通过PCR，间接免疫荧光等方法鉴定，MVA-LMP2A可以很好的表达EBVLMP2外源基因。IFN-γ免疫斑点法(ELISOPT)检测MVA-LMP2A免疫过的小鼠脾淋巴细胞，实验结果表明MVA-LMP2A可以很好的诱导小鼠体内产生EBVLMP2特异性免疫应答。本专利技术的一个目的是提供一种携带EB病毒潜伏膜蛋白2(EBVLMP2)外源基因，且不携带除EBVLMP2以外任何外源基因的EBVLMP2重组痘苗病毒。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中MVA-LMP2A重组病毒选用高度减毒、复制缺陷型的安卡拉株痘苗病毒株构建。携带的EBVLMP2为长度大小为1.5kb的基因序列(SEQIDNO.7)。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中MVA-LMP2A重组病毒除目的基因以外不携带其他的外源基因。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中使用的携带外源基因EBV-LMP2的质粒为PZL-GFP-LMP2重组质粒。本专利技术的另一个目的是提供一种如上限定的疫苗在治疗EBV相关肿瘤中的应用。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中所说的EBV相关肿瘤是EBVLMP2表达阳性的相关肿瘤。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中MVA-LMP2A重组病毒既可以直接作为单独免疫候选疫苗，又可以以MVA作为载体提成EBVLMP2负载到提呈细胞、干细胞、T淋巴细胞等，诱导特异性细胞免疫应答。具体而言，本专利技术所提供的是一种仅携带外源基因EBVLMP2的重组MVA的构建及应用，包括下述步骤：1)利用本实验室已构建的携带GFP的PZL-GFP质粒，该质粒在GFP与多克隆位点两端包含两段可以与MVA发生同源重组的序列，并且在GFP与多克隆位点之间包含一段与GFP另一端可以发生自身同源重组的序列，从而脱去标记基因GFP，获得仅携带外援基因EBVLMP2的重组病毒。选用Pst1和Not1两个限制性内切酶，将EBVLMP2插入PZL-GFP质粒，获得PZL-GFP-LMP2重组质粒(如图1所示)；2)PZL-GFP-LMP2重组质粒与MVA共同感染BHK-21细胞，重组质粒与病毒发生同源序列重组后，荧光显微镜观察可见细胞呈绿色，即表达绿色荧光蛋白，经几轮筛选后，获得纯的MVA-GFP-LMP2A病毒；3)依据获得的重组病毒GFP基因两端的同源序列可以发生自身同源重组，对已获得的MVA-GFP-LMP2A病毒进行连续传代及筛选，获得脱去GFP基因，无绿色荧光蛋白表达的MVA-LMP2A重组病毒。PCR法、间接免疫荧光法等检测方法对获本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株携带EB病毒潜伏膜抗原2基因的重组痘苗病毒，其特征在于所述的重组痘苗病毒携带EB病毒潜伏膜蛋白2(EBVLMP2)外源基因，且不携带除EBVLMP2以外任何外源基因。
【技术特征摘要】
1.一株携带EB病毒潜伏膜抗原2基因的重组痘苗病毒，其特征在于所述的重组痘苗病毒携带EB病毒潜伏膜蛋白2(EBVLMP2)外源基因，且不携带除EBVLMP2以外任何外源基因。2.如权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于所述的重组痘苗病毒选用高度减毒、复制缺陷型的安卡拉株痘苗病毒株构建。3.如权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于所述的携带的EBVLMP2为EBVLMP2全长基因，长度大小为1.5kb的基因序列(SEQIDNO.7)。4.一种制备携带EB病毒潜伏膜抗原2基因的重组痘苗病毒的方法，利用PZL-GFP-LMP2重组质粒系统，获得脱去G...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾毅，王湛，孙立莹，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，
类型：发明
国别省市：北京,11
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