青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株、构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株、构建方法及应用，涉及肿瘤免疫学和光学成像技术领域，本发明专利技术通过青色荧光蛋白质粒转染和G418药物筛选，获取青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株，从而实现青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株在肿瘤免疫光学研究中的应用，如实现通过显微光学成像对CTL杀伤肿瘤细胞的全过程进行观察研究，或在体内实现对肿瘤微环境的多色标记和显微动态成像，或在肿瘤治疗过程中实现对肿瘤微环境中的肿瘤细胞和多种免疫细胞以及血管之间的相关作用进行实时动态光学成像观察。

Green fluorescent protein labeled tumor cell line, construction method and Application

The invention discloses a tumor cell line, a green fluorescent protein labeled construction method and application, involved in tumor immunology and optical imaging technology, the present invention screened by cyan fluorescent protein plasmid and G418 drugs, obtaining cyan fluorescent protein labeled tumor cells, so as to realize the application of tumor cell lines cyan fluorescent protein markers in the study of tumor immunity in optics, such as by optical microscopy on the whole process of CTL killing tumor cells were studied in vivo, or achieve multicolor labeling and micro dynamic imaging of the tumor microenvironment, realize the interaction between tumor microenvironment and tumor cells in various immune cells and blood vessels in real-time optical imaging observation or in the therapy of cancer.

【技术实现步骤摘要】
青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株、构建方法及应用
本专利技术涉及肿瘤免疫学和光学成像
，具体涉及一种青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株、构建方法及应用。
技术介绍
近年来，肿瘤免疫治疗已经成为癌症治疗研究中最为热门的领域，并被公认为是最有可能攻克癌症的治疗方法。对于肿瘤免疫过程中在什么时间以及地点发生了哪些细胞分子事件，目前依然知之甚少，而不断发展的光学成像技术具有高灵敏度、高时间与空间分辨率、多参数检测和低损伤等特点(参见骆清铭,张智红.光学学报,2011,31(9):119-125.)，在肿瘤免疫学研究中发挥了巨大潜能，它能够对肿瘤免疫过程中肿瘤细胞与免疫细胞之间的作用过程提供直观可视化动态信息。荧光蛋白的出现为光学显微成像提供了十分有力的工具，显微光学成像结合荧光蛋白标记的肿瘤细胞株以及转基因动物模型，使得活体光学显微成像观察多色标记的肿瘤微环境成为可能。对于表达荧光蛋白的肿瘤细胞及其应用上，早在1997年，Hoffman实验室第一次将筛选出稳定表达GFP荧光蛋白的肿瘤细胞株，并将该肿瘤细胞株接种到小鼠体内，建立了多种荧光蛋白标记的荷瘤鼠模型(参见ChishimaT,MiyagiY,WangX,etal.CancerResearch(1997)57(10):2042.)。2003年MengYang博士等人也曾将表达RFP的肿瘤细胞株种植到GFP标记全身细胞的转基因裸鼠上，实现了肿瘤微环境的双色标记(参见YangM.,LiL.,JiangP.,etal.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmeric(2003)100(24):14259-14262)。目前对于肿瘤细胞的荧光蛋白标记还主要集中在绿色荧光(GFP)以及红色荧光(RFP)(参见HoffmanR.M.,YangM.NatureProtocols(2006)1(2):928-935)，这两类荧光蛋白的亮度均比较好，在研究肿瘤免疫的光学分子成像过程应用广泛。为便于对肿瘤微环境进行成像，除了会用到各种荧光蛋白标记的肿瘤细胞株之外，还会用到多种荧光蛋白标记免疫细胞的转基因小鼠。目前存在的较为常见的荧光蛋白标记免疫细胞的转基因小鼠，如CX3CR1-GFP、CXCR6-EGFP、Foxp3-mRFP等是以表达GFP和RFP居多，限制了荧光蛋白标记的肿瘤细胞与转基因小鼠的配合使用，在实现多色观察肿瘤免疫微环境的过程中存在一定的局限性。
技术实现思路
针对现有技术中存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株、构建方法及应用，获取青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株，实现的青色荧光蛋白标记肿瘤细胞株在肿瘤免疫光学研究中的各种可视化应用。为达到以上目的，本专利技术采取的技术方案是：一种青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株，所述肿瘤细胞株通过青色荧光蛋白质粒稳定转染肿瘤细胞株构建。本专利技术还公开了一种青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株的构建方法，包括以下步骤：S1，采用pcDNA3.1为质粒载体制得表达青色荧光蛋白的质粒；使用表达青色荧光蛋白的质粒对肿瘤细胞株进行转染；S2，通过G418完全培养基对细胞进行培养筛选制得青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株。本专利技术还公开了一种青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株的应用，所述青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株用于在体外与特异性CTL进行共孵育，以观察特异性CTL对肿瘤细胞的杀伤全过程。在上述技术方案的基础上，所述肿瘤细胞株为B16肿瘤细胞株。在上述技术方案的基础上，所述青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株还用于注射到多种荧光蛋白标记免疫细胞的动物皮窗中，并联合DiR-BOA荧光染料标记血管，以活体动态观察肿瘤微环境中的肿瘤细胞与免疫细胞。在上述技术方案的基础上，所述青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株还用于注射到动物皮窗中，以观察采用肿瘤治疗方案后的肿瘤治疗效果。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术通过青色荧光蛋白转染和G418药物筛选，获取青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株，从而实现青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株在肿瘤免疫光学研究中的应用，如实现通过显微光学成像对CTL对肿瘤细胞杀伤全过程进行观察研究，或在体内实现对肿瘤微环境的多色标记和显微动态成像，或在肿瘤治疗过程中实现对肿瘤微环境中的肿瘤细胞和多种免疫细胞以及血管之间的相关作用进行实时动态光学成像观察，进而可以实现对多种肿瘤免疫治疗方案进行长时程活体动态成像的直观评估，克服了常规GFP、RFP荧光蛋白标记在肿瘤多色光学成像研究中的局限性。附图说明图1为青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株的构建方法的流程示意图；图2为表达青色荧光蛋白的质粒构建图；图3为青色荧光蛋白标记的B16肿瘤细胞株的光学成像图；图4为共聚焦显微成像观察CTL对CFP-B16肿瘤细胞的动态杀伤过程图；图5为C57BL/6小鼠皮下接种CFP-B16肿瘤细胞后在不同治疗方案下的肿瘤体积生长变化曲线图；图6为EGFP转基因C57BL/6小鼠皮窗接种CFP-B16肿瘤细胞后，在CTX-ACT联合免疫治疗过程中，肿瘤微环境的肿瘤细胞与宿主免疫细胞的空间分布和相互作用的大视场显微光学成像图。具体实施方式以下结合附图及实施例对本专利技术作进一步详细说明。实施例1：青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株本专利技术实施例提供一种青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株：肿瘤细胞株通过青色荧光蛋白质粒稳定转染肿瘤细胞株构建。其中，青色荧光蛋白，英文全称为cyanfluorescentprotein，简称为CFP。实施例2：青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株的构建方法参见图1所示，本专利技术实施例还公开了一种青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株的构建方法，包括以下步骤：S1，采用pcDNA3.1为质粒载体制得表达青色荧光蛋白的质粒，参见图2所示；使用表达青色荧光蛋白的质粒对肿瘤细胞株进行转染；S2，通过G418完全培养基对细胞进行培养筛选制得青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株。实施例3：青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株的应用本专利技术实施例还公开了一种青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株的应用，肿瘤细胞株为B16肿瘤细胞株，青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株用于在体外与特异性CTL进行共孵育，以观察特异性CTL对肿瘤细胞的杀伤全过程。青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株用于注射到多种荧光蛋白标记免疫细胞的动物皮窗中，并联合DiR-BOA荧光染料标记血管，以活体动态观察肿瘤微环境中的肿瘤细胞与免疫细胞。青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株用于注射到动物皮窗中，以观察采用肿瘤治疗方案后的肿瘤治疗效果。实施例4：CFP-B16肿瘤细胞株的筛选和光学成像为了对CFP-B16进行光学成像，首先要获得能稳定表达青色荧光蛋白的B16黑色素瘤细胞株，简称CFP-B16：(1)用pcDNA3.1-CFP荧光蛋白质粒对B16细胞株进行转染；(2)转染24h后，使用荧光显微镜观察每孔细胞的发光情况，确定转染效率，将细胞消化并稀释到96孔板，每孔10个细胞左右，使用含1mg/ml浓度的G418完全培养基对细胞进行培养，在荧光显微镜观察是否有稳定发光的细胞团；(3)约一个星期左右可以看到有发光的细胞团，不发光的细胞大量死亡，将发光的细胞团再次消化稀释到96孔板中，每孔保持2-3个细胞，并继续用含本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株，其特征在于：所述肿瘤细胞株通过青色荧光蛋白质粒稳定转染肿瘤细胞株构建。

【技术特征摘要】
1.一种青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株，其特征在于：所述肿瘤细胞株通过青色荧光蛋白质粒稳定转染肿瘤细胞株构建。2.一种如权利要求1所述的一种青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，采用pcDNA3.1为质粒载体制得表达青色荧光蛋白的质粒；使用表达青色荧光蛋白的质粒对肿瘤细胞株进行转染；S2，通过G418完全培养基对细胞进行培养筛选制得青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株。3.一种如权利要求1所述的一种青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株的应用，其特征在于：所述青色荧光蛋白标记的肿瘤细胞株用于在体外与特异性CTL进行共孵育，以观察特异性...

【专利技术属性】
技术研发人员：张智红，祁淑红，
申请(专利权)人：华中科技大学，华中科技大学鄂州工业技术研究院，
类型：发明
国别省市：湖北,42