用于降解烟叶中纤维素的XC‑19‑1菌株及其应用制造技术

本发明专利技术属于烟草微生物发酵技术领域，具体涉及一株用于降解烟叶中纤维素的枯草芽孢杆菌XC‑19‑1菌株及其在烟叶发酵中的应用。该菌株为枯草芽孢杆菌XC‑19‑1，现保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017351。本发明专利技术通过特定菌株的筛选，设计了较为简便的菌剂处理烟叶的技术方案，使得本发明专利技术具有：工艺流程较为简便，烟叶处理成本较低，且处理周期较短，可明显降低烟叶中的纤维素含量等技术优点，因而在卷烟制造技术领域具有较好地推广应用价值。

For the degradation of cellulose in tobacco XC 19 strain 1 and its application

The invention belongs to the technical field of tobacco fermentation, in particular to a strain for degradation of cellulose in tobacco leaves of Bacillus subtilis XC 19 strain 1 and its application in the fermentation of tobacco leaves. The strain was identified as Bacillus subtilis XC 19 1, now preserved in Wuhan Chinese type culture collection center, the preservation number is CCTCC NO:M 2017351. The invention selects a specific strain, design scheme of agent processing tobacco is simple, the invention has the advantages of simple process, low cost and tobacco processing, processing cycle is short, can significantly reduce the cellulose content in tobacco leaves and other technical advantages, so it has better application value in technology the field of cigarette manufacturing.

【技术实现步骤摘要】
用于降解烟叶中纤维素的XC-19-1菌株及其应用
本专利技术属于烟草微生物发酵
，具体涉及一株用于降解烟叶中纤维素的枯草芽孢杆菌XC-19-1菌株及其在烟叶发酵方面的应用。
技术介绍
纤维素是烟叶的主要结构成分，与半纤维素、木质素等物质共同组成了烟草细胞壁，决定着烟叶完整性，其含量与烟草品质息息相关。纤维素对烟叶燃烧性有正向作用，可使烟叶持火力增加；但纤维素含量过高对烟叶品质有负面影响：首先，易造成烟叶组织破碎，影响加工可塑性；其次，会影响烟叶吸食品质，导致刺激性大，杂气重，香气掩盖等；再次，大量的纤维素在超过600℃的温度下会热裂解生成稠环芳烃（PAH），影响烟叶吸食安全性。因此，探索安全有效的技术方法降解烟草纤维素，使其转化为水溶性还原糖等对烟草品质有利的小分子物质，从而有效地提高烟叶质量及安全性，已成为科技工作者普遍关注的问题。微生物发酵技术具有效率高、操作简单、条件温和以及成本低廉等特点，因此筛选特异性微生物对烟叶进行发酵，从而改善烟叶品质一直是近年来的研究热点。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供了一株能够高效降解烟叶中纤维素物质的枯草芽孢杆菌XC-19-1菌株，从而能够有效促进烟叶中大分子纤维素的降解，提高烟叶整体品质。本申请所采取的详细技术方案如下。一株用于降解烟叶中纤维素的XC-19-1菌株，该菌株属于枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），最初是由2015年河南许昌B2F烟叶中分离而来，其保藏名称为：枯草芽孢杆菌XC-19-1，分类学名称为BacillussubtilisXC-19-1，已于2017年6月19日保藏于武汉中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCCNO：M2017351。利用所述用于降解烟叶中纤维素的XC-19-1菌株所制备的菌剂，通过如下步骤制备而成：（1）活化菌种，将XC-19-1菌株置于初筛固体培养基上，37℃条件下活化培养48h~72h；（2）制备种子液，挑取步骤（1）中所培养的菌落，接种于液体种子培养基中，37℃摇床培养；（3）扩大培养，将步骤（2）中种子液转接液体复筛培养基，培养至OD600=1.8~2.0；（4）制备菌剂，将步骤（3）中发酵液离心，弃上清，然后加入无菌水进行悬浮，调整活菌数为（9~10）×107个/mL。制备过程中，培养基组分单位以g/L计，所述初筛固体培养基组成为：羧甲基纤维素钠10.0，蛋白胨10.0，酵母粉5.0，KH2PO41.0，MgSO4•7H2O0.2，C6H14O62.0，NaCl10.0，琼脂20.0；pH=7.0左右；液体种子培养基组成为：羧甲基纤维素钠10.0，蛋白胨10.0，酵母粉5.0，KH2PO41.0，MgSO4•7H2O0.2，C6H14O62.0，NaCl10.0；pH=7.0左右；液体复筛培养基组成为：麸皮汁50.0mL/L，玉米粉10.0，牛肉膏3.0，蛋白胨2.0，NaCl5.0，KH2PO41.0，K2HPO41.0，MgSO4•7H2O0.5，pH=7.0左右。所述利用XC-19-1菌株所制备的菌剂在降解烟叶纤维素中的应用，按烟叶质量的1~3%比例，将制备好的菌剂均匀喷洒于烟叶表面，在温度35℃~40℃、60%~80%湿度条件下，发酵处理48h~72h（优选处理条件为：37℃、75%湿度条件下，处理60h），发酵完成后，再将烟叶加热处理使细菌及其产生的纤维素酶失活即可（70~100℃加热处理10~30min，优选80℃加热处理20min）。一种降低烟叶中纤维素含量的方法，包括如下步骤：（1）制备处理菌剂，具体而言，以枯草芽孢杆菌XC-19-1发酵培养，制备成活菌数为（9~10）×107个/mL的水剂；（2）将步骤（1）中所制备处理菌剂均匀喷施于待处理烟叶表面，35℃~40℃、60%~80%湿度条件下，发酵处理48h~72h，发酵完成后，再将烟叶加热处理使细菌及其产生的纤维素酶失活。本专利技术中以烟叶中含量较高的纤维素为作用目标，通过特定菌株筛选，以及特定剂量使用，在较短时间内较好地降低了烟叶中的纤维素含量。初步测定结果表明，烟叶中纤维素的降解率可达30%以上，总糖与还原糖含量均有明显提高，烟叶感官质量也提升较为明显，表现出较好地降低烟叶中纤维素含量的技术效果。总体而言，本专利技术通过特定菌株的筛选，设计了较为简便的菌剂处理烟叶的技术方案，使得本专利技术具有：工艺流程较为简便，烟叶处理成本较低，且处理周期较短，可明显降低烟叶中的纤维素含量并改善烟叶品质等技术优点，因而在卷烟制造
具有较好地推广应用价值。附图说明图1为XC-19-1菌株在油镜下的形态图；图2为基于XC-19-1菌株16SrDNA基因序列构建的系统发育进化树。具体实施方式下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前就下述实施例中涉及部分物料、实验设备等情况简要介绍如下。烟草物料：菌株筛选所用烟叶为2015年河南许昌B2F烟叶；菌株作用效果考察所用烟叶为2015年河南平顶山C3F，均由河南中烟工业有限责任公司提供。实施例1本实施例仅就XC-19-1菌株的筛选及鉴定过程简要介绍如下。XC-19-1菌株，最初是由2015年河南许昌B2F烟叶中分离获得。其菌落在初筛固体培养基上呈现乳白色，无光泽，不透明，表面平整或出现不规则褶皱凸起，菌落近圆形或不规则，菌落边缘不规则细波状。油镜下形态如图1所示，可观察到细菌分布均匀，为杆状，很少呈链状。采用16SrDNA基因片段为通用引物，对该菌株进行PCR以及克隆测序，可获得1500bp序列，进行系统进化分析，显示菌株XC-19-1与枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的同源性高达100%，即与枯草芽孢杆菌的亲缘关系最近（如图2所示）。进一步对菌株进行生理生化分析，结果如表1所示。表1XC-19-1生理生化实验结果：注：+表示阳性，-表示阴性。最终，鉴定认为XC-19-1菌株属芽孢杆菌属（Bacillus），其分类学名称为BacillussubtilisXC-19-1，于2017年6月19日提交武汉中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏（地址：武汉大学），2017年6月30日保藏鉴定为存活，其保藏编号为CCTCCNO：M2017351。实施例2为将实施例1中筛选所得XC-19-1菌株用于降解烟叶中纤维素，需首先将该菌株制备成易于使用的菌剂，具体制备过程如下。（1）活化菌种，将XC-19-1菌株置于初筛固体培养基上，37℃条件下培养48h~72h；（2）制备种子液，挑取步骤（1）中所培养的菌落，接种于液体种子培养基中，37℃摇床培养过夜；（3）扩大培养，将步骤（2）中种子液转接液体复筛培养基，培养至OD600=2.0左右；（4）制备菌剂，将步骤（3）中发酵液离心，弃上清，然后加入无菌水进行悬浮，调整活菌数为（9~10）×107个/mL。实施例3利用实施例2中所制备菌剂处理烟叶时，具体步骤为：处理烟叶时，按照2%的烟叶质量比，将上述菌剂用喷雾器均匀喷洒于烟叶表面，然后调整烟叶水分含量为25%；置于特定温湿度条件下发酵一定时间后，80℃处理20min，使细菌及其产生的纤维素酶失活。为确定菌剂的最佳作用温湿度条件及时间，专利技术人进行了正交实验设计，相关实验过程本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株用于降解烟叶中纤维素的XC‑19‑1菌株，其特征在于，该菌株属芽孢杆菌属

【技术特征摘要】
1.一株用于降解烟叶中纤维素的XC-19-1菌株，其特征在于，该菌株属芽孢杆菌属Bacillus，保藏名称为：枯草芽孢杆菌XC-19-1，分类学名称为BacillussubtilisXC-19-1，已于2017年6月30日保藏于武汉中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCCNO：M2017351。2.利用权利要求1所述用于降解烟叶中纤维素的XC-19-1菌株所制备的菌剂，其特征在于，通过如下步骤制备而成：（1）活化菌种，将XC-19-1菌株置于初筛固体培养基上，活化培养；（2）制备种子液，挑取步骤（1）中所培养的菌落，接种于液体种子培养基中，摇床培养；（3）扩大培养，将步骤（2）中种子液转接液体复筛培养基，培养至OD600=1.8~2.0；（4）制备菌剂，将步骤（3）中发酵液离心，弃上清，然后加入无菌水进行悬浮，调整活菌数为（9~10）×107个/mL。3.如权利要求2所述利用XC-19-1菌株所制备的菌剂，其特征在于，以g/L计，所述初筛固体培养基组成为：羧甲基纤维素钠10.0，蛋白胨10.0，酵母粉5.0，KH2PO41...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨宗灿，刘向真，冯颖杰，许衡，李家美，杨永锋，彭玉富，张耀广，
申请(专利权)人：河南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：河南,41