一种检测乙型肝炎病毒耐药性基因的引物、试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种检测乙型肝炎病毒耐药性基因的引物、试剂盒和方法，所述引物包括扩增引物和测序引物，所述扩增引物具有如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的碱基序列，所述测序引物具有如SEQ ID No:3所示的碱基序列。本发明专利技术的检测乙型肝炎病毒耐药性基因的引物是针对HBV YMDD突变位点，在保守区域设计而得的，特异性强，灵敏度高；本发明专利技术的检测方法是基于Sanger测序技术进行的，可以检测六种药物的主要的耐药突变位点，并且可以检测到143到180位点区间内的所有突变，检测结果更加准确，也可以发现该区间内的新突变位点，有助于进一步指导药物的使用。

【技术实现步骤摘要】
一种检测乙型肝炎病毒耐药性基因的引物、试剂盒和方法
本专利技术属于生物检测
，更具体地，本专利技术涉及一种基于Sanger测序技术检测乙型肝炎病毒耐药性基因的引物、试剂盒和方法。
技术介绍
乙型肝炎病毒(HBV)是指引起人类急、慢性肝炎的DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科，是导致慢性肝炎、肝癌和肝硬化的重要因素。基因组长3.2kb，为部分双链环状DNA。HBV的抵抗力较强。乙型肝炎病毒感染已成为全球严重的公共卫生问题，严重危害着人类的健康。全球约有20亿HBV感染者，其中约有4亿将发展为乙肝，全球每年约有60万人死于与HBV感染相关的疾病。乙肝患者在治疗过程中，曾经采用了大量的药物进行抗病毒治疗，而且，在机体进行药物的治疗的过程中，乙肝病毒基因也在发生着快速的变异，乙肝患者用药很可能会导致乙肝病毒的定向变异，从而产生乙肝病毒的耐药性。目前最主要的药物是干扰素和核苷类药物。主要核苷类药物有：拉米夫定(通过干扰病毒的复制结合位点(乙肝病毒进行逆转录的活性部位YMDD)204位点，如果长期服用该药物会出现耐药性，变异多发生于酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)位点，YMDD变异是204位蛋氨酸(M)被缬氨酸(V)或者异亮氨酸(I)所取代，改变了HBVDNA聚合酶的亚结构，产生了耐药使得血清中已经阴转的乙肝病毒DNA重新出现，肝功能异常甚至伴有病情的突发)、阿德福韦酯(相关的耐药突变多为多点突变，主要耐药位点为rt181、rt236)、恩替卡韦(耐药突变主要发生在169、180、184、202、204、250位点)、替比夫定(耐药突变主要发生在204位点)、恩曲他滨(耐药突变主要发生在173、180、204位点)和替诺福韦(耐药突变主要发生在194位点)等。对乙肝患者进行乙肝病毒变异检测，可以更加准确的了解乙肝患者的病情，对症下药，避免盲目用药现象出现，同时还能够以检查结果为依据，判断治疗效果，根据患者的具体病情对患者制定最佳的治疗方案，有利于患者病情早日康复。目前市场主要的检测耐药基因的技术有：1.PCR-限制性酶切片段多态性片段分析(PCR-RFLP)：PCR-RFLP是将PCR技术、RFLP分析与电泳方法联合应用，先将待测的靶DNA片段进行复制扩增，然后应用DNA限制性内切酶对扩增产物进行酶切，最后经电泳分析靶DNA片段是否被切割而分型。DNA限制性内切酶具有识别特定的DNA序列并在特定的部位切断DNA双链的活性功能，DNA分子由于突变(核苷酸的置换、插入或缺失)改变(或形成)了限制性内切酶识别序列，使DNA限制性内切酶不能(或可以)将靶DNA片段切断，电泳检测时，存在相应DNA限制性内切酶识别序列者原DNA片段变成短片段；不存在相应DNA限制性内切酶识别序列者原DNA片段长度将不发生变化。该方法实验简单，快速，无需特殊仪器。不足之处在于对酶切的条件要求较高，假阴性率高。多态性水平过分依赖于限制性内切酶的种类和数量。只能分析已知序列特异位点的基因突变，且有些耐药突变很难找到合适的限制性内切酶，检测的耐药位点有限。2.实时荧光PCR法：该方法利用PCR反应中引物在3’末端存在错配时不能正确延伸的特点，将突变位点设计在荧光定量PCR引物的3’末端，采用合适的引物浓度，Touch-downPCR反应程序，同时结合嵌合有SyBrGreenI染料的PCR产物的熔点曲线。根据荧光定量PCR信号和熔点曲线，即可判断是否发生耐药突变。该方法只能检测已知位点的突变，且随着位点的增加，成本工作量都会增加。3.基因芯片法：该方法是将大量特定的基因片段或寡核苷酸片段作为探针有序地和高密度地排列在固定于玻璃或者膜等载体上，然后与待测有标记的样品核酸按碱基配对的原则进行杂交，最后通过检测得出结果。该方法也只能检测已知位点的突变，样本的制备和标记较为繁琐，仪器昂贵，检测成本高。4.焦磷酸测序法：该方法在每一轮测序反应中，只加入一种三磷酸脱氧核糖核酸(dNTP)，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团，该基团最终转化为可见光信号，并转化为一个峰值。该方法只能对已知序列的DNA片段序列进行验证，不能分析未知DNA序列。目前所有的乙肝病毒耐药位点的检测技术都是针对已知序列或者特异的几个位点进行检测，不能检测未知的DNA片段序列。随着抗乙肝病毒药物的增加，乙肝病毒耐药的位点更加的多样性，因此，势必对乙肝病毒耐药位点的检测技术提成了新的更高的要求。
技术实现思路
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种检测乙型肝炎病毒耐药性基因的引物、试剂盒和方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采取了以下技术方案：一种检测乙型肝炎病毒耐药性基因的引物，所述引物包括扩增引物和测序引物，所述扩增引物具有如SEQIDNo:1和SEQIDNo:2所示的碱基序列，所述测序引物具有如SEQIDNo:3所示的碱基序列。本专利技术还提供了一种检测乙型肝炎病毒耐药性基因的试剂盒，所述试剂盒包括上述扩增引物和测序引物。在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括UNG(UDG)/dUTP体系，UNG(UDG)/dUTP体系是一种防污染体系，能消除因PCR产物污染引起的假阳性检测结果。在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括热启动Taq酶，热启动Taq酶采用化学修饰，经95℃热激15分钟，Taq酶才能发挥作用，热启动Taq酶可减少引物二聚体的形成增加反应特异性。本专利技术还提供了检测乙型肝炎病毒耐药性基因的方法，使用上述试剂盒进行检测，包括以下步骤：(1)、提取、纯化待测样品中的DNA；(2)、以上述DNA作为模板，利用扩增引物进行PCR扩增，获得扩增产物，纯化扩增产物；(3)、利用测序引物对上述PCR扩增产物进行测序PCR反应，再对测序PCR反应产物进行Sanger测序，确定耐药性基因位点。在其中一些实施例中，步骤(2)中所述PCR扩增的反应体系为：HBVPCR反应液37ul、酶反应液3ul、模板10ul；所述HBVPCR反应液包括10XPCRbuffer5ul、25mMMgCl20.5ul、25mMdNTPs(含U)1ul、H2O30.5ul；所述酶反应液包括UNG酶0.1ul、热启动Tag酶0.5ul，余量为超纯水和甘油。在其中一些实施例中，步骤(2)中所述PCR扩增的反应程序为：50℃2min；95℃15min预变性；94℃30s—55℃30s—72℃45s，40个循环；72℃7min。在其中一些实施例中，步骤(3)中所述测序PCR反应的反应体系为：PCR扩增产物10-50ng、BigDye2ul、BigDyeBuffer3ul、测序引物1ul、无菌纯化水加至20ul。在其中一些实施例中，步骤(3)中所述测序PCR反应的反应程序为：96℃1min；96℃10s、50℃5s、60℃4min，25个循环；4℃保温。双脱氧终止法是上个世纪70年代由弗雷德·桑格尔专利技术的，他因此于1980年再度获得了诺贝尔奖。2001年，AllanMaxam和WalterGibert专利技术了Sanger测序法。Sanger测序利用双脱氧终止法，即在Sanger测序反应中，利用碱基互补的原则合成新的DNA链，然而在测序引物延伸的过程中，如果遇到带有荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测乙型肝炎病毒耐药性基因的引物，其特征在于，所述引物包括扩增引物和测序引物，所述扩增引物具有如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的碱基序列，所述测序引物具有如SEQ ID No:3所示的碱基序列。

【技术特征摘要】
1.一种检测乙型肝炎病毒耐药性基因的引物，其特征在于，所述引物包括扩增引物和测序引物，所述扩增引物具有如SEQIDNo:1和SEQIDNo:2所示的碱基序列，所述测序引物具有如SEQIDNo:3所示的碱基序列。2.一种检测乙型肝炎病毒耐药性基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的检测乙型肝炎病毒耐药性基因的引物。3.根据权利要求2所述的检测乙型肝炎病毒耐药性基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括UNG(UDG)/dUTP体系。4.根据权利要求3所述的检测乙型肝炎病毒耐药性基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括热启动Taq酶。5.一种检测乙型肝炎病毒耐药性基因的方法，其特征在于，使用权利要求2～4任一项所述的试剂盒进行检测，包括以下步骤：(1)、提取、纯化待测样品中的DNA；(2)、以上述DNA作为模板，利用扩增引物进行PCR扩增，获得扩增产物，纯化扩增产物；(3)、利用测序引物对上述PCR扩增产物进行测序PCR反应，再对测序PCR反应产物进行Sanger测序，确定耐药性基因位点。6.根据权利要求5所述的检测乙型肝炎病毒耐药性基因的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李葆华，蒋析文，刘悦，甘小洪，马道亮，
申请(专利权)人：广州立菲达安诊断产品技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44