猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型、美洲型双重微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型、美洲型双重微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒。本发明专利技术提供了的引物探针组合由LV‑F1R1P1和VR2332‑F1R1P1组成；LV‑F1R1P1由LV‑F1、LV‑R1和LV‑P1组成；LV‑F1为序列1所示；LV‑R1为序列2所示；LV‑P1如序列3所示；VR2332‑F1R1P1由VR2332‑F1、VR2332‑R1和VR2332‑P1组成；VR2332‑F1为序列4所示；VR2332‑R1为序列5所示；VR2332‑P1如序列6所示。本发明专利技术对于猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的防控具有重大的应用价值，有助于从源头控制疫情、有效预防猪疫病的大规模爆发。

【技术实现步骤摘要】
猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型、美洲型双重微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒
本专利技术属于病毒检测领域，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型、美洲型双重微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)引起的一种以怀孕母猪繁殖障碍、尤其哺乳仔猪呼吸困难为特征的高度接触性传染病。本病在1987年首次暴发于美国，随后在加拿大、欧洲与亚洲相继出现，目前已经在世界范围内流行，每年造成巨大的经济损失。我国在1995年首次出现PRRS，随后迅速蔓延。2006年在我国全面暴发了体温高、发病率高、死亡率高为主要临床特征的猪“高热病”，而导致该病的病原是较之前在国内流行的经典PRRSV发生变异的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒。目前为止，PRRSV有两种型，即以ATCCVR-2332(VR株)毒株为代表的美洲型和以Lelystadvirus(LV株)为代表的欧洲型，而美洲型又分为两种亚型，经典美洲株和高致病性美洲株，三种亚型毒株在基因序列上存在一定差异。我国国内主要流行的为美洲型毒株，而欧洲株在国内也偶有发现，因此在临床上需要一种能够快速诊断PRRSV的检测方法。传统的PRRSV检测方法主要包括病毒的分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、间接免疫荧光试验(IFA)和间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)等。目前最常用核酸检测方法有RT-PCR和荧光RT-PCR。传统的PRRSV检测方法存在需要使用高成本仪器设备，试验所需时间较长等不足。RT-PCR和荧光RT-PCR虽然较之以往方法具有特异性更强、灵敏度高、重复性好，且自动化程度高等特点，但是上述方法均只能实现定性和半定量的检测，无法对病毒核酸进行精确定量，在灵敏度和敏感性特异性上仍存在一定的局限性。数字化PCR(DigitalPCR，dPCR)的概念早在1999年就由BertVogelstein采用并发表相关文献，其初衷是为了能够从临床样品(如尿液、淋巴液、血浆、粪便等)大量的正常体细胞中检测出微量的突变细胞，但由于当时能用于稀释样品的耗材只是384孔板，因此还不能非常好地体现数字PCR的核心理念——“无限稀释”(terminaldilution)。Bio-Rad公司的QX200系统核心的微滴化技术能够将一份样品分成20,000个纳升级的微滴，本质上将传统定量PCR的一个test变成20,000个test，大大提高了核酸序列检测的灵敏度和精准度，是对“无限稀释”这一概念的完美演绎，其方法原理可称为微滴式数字化PCR(DropletDigitalPCR，ddPCR)。QX200ddPCR系统包括两台仪器：微滴发生器和微滴分析仪，及其相关的耗材。微滴发生器将每个样品分成20,000个均匀的纳升级微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。随后微滴转移至96孔PCR板上，开展终点PCR扩增。采用微滴分析仪(dropletreader)逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。与传统的定量PCR相比，数字PCR的精确度和灵敏度更佳。利用微滴式数字PCR技术，研究人员可以检测稀有突变，精确测定拷贝数变异，并对基因表达进行绝对定量。凭借QX200系统的高灵敏度，研究人员如今可检测浓度低至1/1,000,000的靶分子。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型、美洲型双重微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒。本专利技术提供了一种引物探针组合，由引物探针组LV-F1R1P1和引物探针组VR2332-F1R1P1组成；所述引物探针组LV-F1R1P1由引物LV-F1、引物LV-R1和探针LV-P1组成；所述引物LV-F1为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物LV-R1为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述探针LV-P1，一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团，核苷酸序列为如下(a5)或(a6)：(a5)如序列表的序列3所示；(a6)如将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加所示；所述引物探针组VR2332-F1R1P1由引物VR2332-F1、引物VR2332-R1和探针VR2332-P1组成；所述引物VR2332-F1为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(a2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物VR2332-R1为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(a4)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；所述探针VR2332-P1，一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团，核苷酸序列为如下(a5)或(a6)：(a5)如序列表的序列6所示；(a6)如将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加所示；所述探针LV-P1和所述探针VR2332-P1具有不同颜色的荧光报告基团。具体来说，探针LV-P1探针的5’末端标记荧光基团FAM，3’末端标记荧光淬灭基团BHQ1。具体来说，探针VR2332-P1的5’末端标记荧光基团HEX，3’末端标记荧光淬灭基团BHQ1。所述引物探针组合的用途为如下(b1)、(b2)、(b3)、(b4)、(b5)或(b6)：(b1)鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型；(b2)制备用于鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的试剂盒；(b3)检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型；(b4)制备用于检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的试剂盒；(b5)检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的含量；(b6)制备用于检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型含量的试剂盒。本专利技术还保护所述引物探针组合的应用，为如下(b1)、(b2)、(b3)、(b4)、(b5)或(b6)：(b1)鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型；(b2)制备用于鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的试剂盒；(b3)检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种引物探针组合，由引物探针组LV‑F1R1P1和引物探针组VR2332‑F1R1P1组成；所述引物探针组LV‑F1R1P1由引物LV‑F1、引物LV‑R1和探针LV‑P1组成；所述引物LV‑F1为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物LV‑R1为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述探针LV‑P1，一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团，核苷酸序列为如下(a5)或(a6)：(a5)如序列表的序列3所示；(a6)如将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加所示；所述引物探针组VR2332‑F1R1P1由引物VR2332‑F1、引物VR2332‑R1和探针VR2332‑P1组成；所述引物VR2332‑F1为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(a2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物VR2332‑R1为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(a4)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；所述探针VR2332‑P1，一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团，核苷酸序列为如下(a5)或(a6)：(a5)如序列表的序列6所示；(a6)如将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加所示；所述探针LV‑P1和所述探针VR2332‑P1具有不同颜色的荧光报告基团。...

【技术特征摘要】
1.一种引物探针组合，由引物探针组LV-F1R1P1和引物探针组VR2332-F1R1P1组成；所述引物探针组LV-F1R1P1由引物LV-F1、引物LV-R1和探针LV-P1组成；所述引物LV-F1为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物LV-R1为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述探针LV-P1，一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团，核苷酸序列为如下(a5)或(a6)：(a5)如序列表的序列3所示；(a6)如将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加所示；所述引物探针组VR2332-F1R1P1由引物VR2332-F1、引物VR2332-R1和探针VR2332-P1组成；所述引物VR2332-F1为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(a2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物VR2332-R1为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(a4)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；所述探针VR2332-P1，一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团，核苷酸序列为如下(a5)或(a6)：(a5)如序列表的序列6所示；(a6)如将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加所示；所述探针LV-P1和所述探针VR2332-P1具有不同颜色的荧光报告基团。2.权利要求1所述引物探针组合的应用，为如下(b1)、(b2)、(b3)、(b4)、(b5)或(b6)：(b1)鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型；(b2)制备用于鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的试剂盒；(b3)检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型；(b4)制备用于检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的试剂盒；(b5)检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的含量；(b6)制备用于检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型含量的试剂盒。3.一种试剂盒，包括权利要求1所述引物探针组合；所述试剂盒的功能为如下(c1)、(c2)或(c3)：(c1)鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型；(c2)检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型；(c3)检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的含量。4.一种检测待测病毒是否为猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的方法，包括如下步骤：以待测病毒的总RNA为模板，采用权利要求1所述引物探针组合进行数字RT-PCR；如果基于探针LV-P1...

【专利技术属性】
技术研发人员：原霖，宋晓晖，王传彬，周智，汪葆玥，杨林，吴佳俊，倪建强，韩焘，訾占超，王晓英，毕一鸣，王静，陈亚娜，
申请(专利权)人：中国动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：北京,11