一种提高液体样品核酸检测灵敏度的样品预处理方法技术

本发明专利技术提供一种提高液体样品核酸检测灵敏度的样品预处理方法，属于核酸检测技术领域，其先取用液体样品，向样品中添加不同组合的有机分子试剂及无机盐，对样品中的核酸进行富集处理，再进行磁珠核酸提取。该样品预处理方法能有效富集检测样品中存在的微量核酸，从而提升检测的灵敏度，降低假阴性的出现概率。

【技术实现步骤摘要】
一种提高液体样品核酸检测灵敏度的样品预处理方法
本专利技术属于核酸检测
，尤其涉及一种可以提高液体样品核酸检测灵敏度的样品预处理方法。
技术介绍
核酸检测在临床及科研中使用非常广泛，也是目前精准医疗中的一个核心技术部分。在现实中，许多样品中核酸含量非常有限，如果检测灵敏度不够，很容易出现假阴性(漏诊)，高检测灵敏度非常重要。而提高检测灵敏度的重要一环是样品核酸提取，如果样品中核酸得到充分富集，提取的核酸量明显增高，该样品检测的灵敏度就提高了。以前柱式核酸提取是常用方法。目前应用比较广的是磁珠核酸提取法，一般来说磁珠法比柱式核酸提取法核酸得率明显高，但最多也只是高出数倍。而不同样品中相关核酸含量可能相差多个数量级。因此，磁珠法依然有灵敏度的问题，依然会漏诊。特别是在医学上最新的肿瘤液体活检技术及血液体液病原体核酸检测，环境及食品相关核酸检测，由于样品中对应核酸含量可能极低，高灵敏度检测就显得非常有必要。
技术实现思路
本专利技术提供一种提高液体样品核酸检测灵敏度的样品预处理方法，其先取用液体样品，向样品中添加不同组合的有机分子试剂及无机盐，对样品中的核酸进行富集处理，再进行磁珠核酸提取。该样品预处理方法能有效富集检测样品中存在的微量核酸，从而提升检测的灵敏度，降低假阴性的出现概率。本专利技术通过以下详细技术方案达到目的：一种提高液体样品核酸检测灵敏度的样品预处理方法，其包括以下步骤：步骤S10提取核酸：取液体样品，向样品中加入载体核酸，混匀，再向其加入TRIZol试剂，漩涡混匀1min，在4℃条件下离心，离心后取上清液；步骤S20沉淀核酸：向步骤S10取得的水相上清液中添加有机分子试剂及无机盐，每加入一种试剂，震荡混匀一次，有机分子试剂及无机盐添加完毕后将样品进行低温处理，再在4℃条件下离心，离心后取沉淀物；所述的有机分子试剂是糖元、明胶和乙醇中的一种或者多种组合；所述的无机盐试剂是氯化钠或者醋酸钠中的一种或者两种；步骤S30重悬沉淀：取未经过步骤S10和步骤S20的样品对步骤S20所获得的沉淀物进行重新悬浮；步骤S40提取核酸：采用常规磁珠法提取样品中的核酸。其中，所述的步骤S20沉淀核酸中低温处理是将样品置于负80℃环境中处理10min-12h。其中，所述的步骤S10提取核酸中所使用的液体样品的体积是0.5-10.0ml；所使用的载体核酸的终浓度为0.5-5.0ng/ul。其中，所述的步骤S20沉淀核酸中所使用的有机分子试剂的终浓度如下：糖元0.05-1.0ug/ul、明胶0.01-0.5％、乙醇40-75％；所使用的无机盐试剂的终浓度如下：氯化钠1-5M、醋酸钠1-5M。一种提高液体样品核酸检测灵敏度的样品预处理方法在提高液体样品核酸检测灵敏度的检测试剂盒或者检测平台中的应用。本专利技术具有的有益效果：有机分子，如载体核酸、糖元、明胶、乙醇，及无机盐，如氯化钠和醋酸钠，可以沉淀液体样品中的核酸，富集样品中存在的微量核酸；一般核酸提取试剂盒一次固定提取0.2-0.5ml样品，本专利技术从大体积液体样品中富集相关核酸分子，最终使样品核酸提取量或样品核酸检测灵敏度比不处理样品提高3-10倍以上。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的描述。步骤S10提取核酸：取1ml病人新鲜血清，放入新的2.0mlEP管中，向该管加入30ul载体核酸，终浓度为2ng/ul，漩涡混匀后，再向其内加入1mlTRIZol试剂，充分剧烈漩涡混匀1min，在4℃条件下以12000rpm的速度离心5min，小心取出水相上清液；步骤S20沉淀核酸：向步骤S10取得的上清液中依次加入100ul1％的明胶、50ul20mg/ml的糖原，125ul2M的NaCl和1ml预冷无水乙醇，每加入一种试剂，震荡混匀一次，上述试剂添加完成后，将样品置于-80℃冰箱中处理30min，然后在4℃条件下以12000rpm的速度离心5min，离心后取沉淀物；步骤S30重悬沉淀：取0.2ml未经过步骤S10和步骤S20的血清样品对步骤S20所获得的沉淀物进行重新悬浮，再进行剧烈漩涡混匀1min；步骤S40提取核酸：采用常规磁珠法提取样品中的核酸。对经过本专利技术提供的方法处理的样品和未经本专利技术提供的方法处理的样品进行扩增病原体目标基因片段，采用的试剂如下表：表1PCR扩增试剂种类及用量表上游引物：TGGACTTCTCTCAATTTTCT下游引物：TGACAGACTTTCCAATCAAT对照组设置如下：a)阳性对照：以已检测阳性的样品DNA为模板；b)阴性对照①：无模板，以水替代；c)阴性对照②：无引物，以水替代。采用的扩增条件如下表：表2PCR扩增条件表将扩增完成的样品PCR产物进行电泳检测，取10μlPCR产物，加入100bpDNAMarker，使用1.5％琼脂糖凝胶电泳，电压130V，电泳时间30分钟。结果显示预处理组扩增条带密度为未进行预处理组条带的10倍以上。qPCR对两个组的最终核酸提取物特定目标基因定量分析也证实其特定目标基因定量相差10倍以上。以上所述实施例仅表达了本专利技术的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本专利技术专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本专利技术的保护范围。因此，本专利技术专利的保护范围应以所附权利要求为准。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高液体样品核酸检测灵敏度的样品预处理方法，其特征在于，其包括以下步骤：步骤S10提取核酸：取液体样品，向样品中加入载体核酸，混匀，再向其加入TRIZol 试剂，漩涡混匀1min，在4℃条件下离心，离心后取上清液；步骤S20沉淀核酸：向步骤S10取得的水相上清液中添加有机分子试剂及无机盐，每加入一种试剂，震荡混匀一次，有机分子试剂及无机盐添加完毕后将样品进行低温处理，再在4℃条件下离心，离心后取沉淀物；所述的有机分子试剂是糖元、明胶和乙醇中的一种或者多种组合；所述的无机盐试剂是氯化钠或者醋酸钠中的一种或者两种；步骤S30重悬沉淀：取未经过步骤S10和步骤S20的样品对步骤S20所获得的沉淀物进行重新悬浮；步骤S40提取核酸：采用常规磁珠法提取样品中的核酸。

【技术特征摘要】
1.一种提高液体样品核酸检测灵敏度的样品预处理方法，其特征在于，其包括以下步骤：步骤S10提取核酸：取液体样品，向样品中加入载体核酸，混匀，再向其加入TRIZol试剂，漩涡混匀1min，在4℃条件下离心，离心后取上清液；步骤S20沉淀核酸：向步骤S10取得的水相上清液中添加有机分子试剂及无机盐，每加入一种试剂，震荡混匀一次，有机分子试剂及无机盐添加完毕后将样品进行低温处理，再在4℃条件下离心，离心后取沉淀物；所述的有机分子试剂是糖元、明胶和乙醇中的一种或者多种组合；所述的无机盐试剂是氯化钠或者醋酸钠中的一种或者两种；步骤S30重悬沉淀：取未经过步骤S10和步骤S20的样品对步骤S20所获得的沉淀物进行重新悬浮；步骤S40提取核酸：采用常规磁珠法提取样品中的核酸。2.根据权利要求1所述的一种提高液体样品核酸检测灵敏度的样品预...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱克卿，元丽娟，王昌富，
申请(专利权)人：上海兰卫医学检验所股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31