一种用于检测结合珠蛋白分型的试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种用于检测结合珠蛋白分型的试剂盒，上述试剂盒包括特定正向引物、特定反向引物及缓冲液；上述缓冲液的成分包括：三羟甲基氨基甲烷，pH为8.0‑8.7；氯化钾；氯化镁Taq酶；脱氧核糖核苷三磷酸；上述特定正向引物及上述特定反向引物为：正向:5’‑ATAATACAGTTCGCGAGCTTCT‑3’；反向:5’‑GGGCAAGATACTCAACCTGTC‑3’。本发明专利技术申请建立了一种从基因角度对Hp进行分析的方法，提供了一种检测结合珠蛋白分型的试剂盒，通过对扩增产物电泳检测即可确定Hp的基因型，该试剂盒操作简便快速、准确，可应用于临床实践。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测结合珠蛋白分型的试剂盒
本专利技术涉及生物医药领域，更具体地，涉及一种检测结合珠蛋白分型的试剂盒。
技术介绍
目前糖尿病患者人群日益增大，也逐渐趋于年轻化，这些患者有很高的并发心血管疾病的风险，粗略统计约有75％的糖尿病患者死于心血管疾病。为了减轻患者高糖血症的症状，减少微血管和大血管并发症的发生，使患者能够过上正常的生活，采用合适的药物预防心血管并发症尤为重要。由于糖尿病患者并发心血管疾病与体内氧化应激有一定的相关性，因此美国心脏病学会以及国际卫生组织(WHO)均推荐使用维生素E等抗氧化剂来预防糖尿病患者心血管并发症。临床发现，不同的糖尿病患者对于维生素E补充所带来的效果差异非常大。有的患者补充维生素E可以明显降低心血管疾病风险；而有些患者却相反，补充维生素E后反而会增加并发心血管疾病的风险，严重时甚至会导致死亡事件。大量科学研究发现，结合珠蛋白的基因型与糖尿病患者并发心脏病的风险密切相关。其中，携带Hp2-2基因型的糖尿病患者罹患心脏病并发症、中风甚至死亡的风险更高，约为携带Hp1-1基因型的糖尿病患者的5倍；而携带Hp2-1基因型的糖尿病患者的心脏病并发风险介于两者之间。而从补充维生素E后的治疗效果看，对于携带有结合珠蛋白Hp2-2基因型的糖尿病患者，经过18个月维生素E治疗后，心脏病和中风发作的几率比未服用维生素E的同类患者少50％，且未出现副作用。而对Hp2-1或Hp1-1基因型的糖尿病患者，补充维生素E则会反而提高其并发心血管疾病的风险。结合珠蛋白(Haptoglobin，Hp)又称触珠蛋白，是血清α2-球蛋白组分中的一种糖蛋白类，是一种能稳定红血球血红蛋白的抗氧化蛋白，可以保护血管壁避免发生炎症。人类结合珠蛋白的基因位于染色体16q22.1，人群中常见的Hp有三种基因型，分别是Hp1-1，Hp2-1和Hp2-2，受控于Hp座位上的一对等位基因Hp1和Hp2，呈共显性遗传。不同地区和人种的Hp1和HP2基因频率各不相同，西方人群的统计数据显示，Hp1-1基因型的概率为16％，Hp2-2基因型的概率为36％，而Hp2-1基因型的概率则为48％。亚洲人以Hp2-2居多，其次为Hp2－1，而Hp1－1最少，我国汉族人种Hp1基因型频率较低，多以Hp2为主。综上所述，携带有结合珠蛋白Hp2-2基因型的糖尿病患者并发心血管疾病甚至死亡风险更高，服用维生素E可以降低其风险；携带Hp2-1或Hp1-1基因型的糖尿病患者虽然并发心血管疾病风险较低，但服用维生素E后其并发风险反而会提高。因此，为了更好地分析判断糖尿病患者心血管疾病的并发风险，合理地进行早期干预，并在临床上给予更可靠准确的用药指导，针对糖尿病患者人群进行结合珠蛋白的基因分型非常必要。目前检测结合珠蛋白分型的方法多是电泳法，电泳前先使待测样品与血红蛋白形成Hp－Hb(结合珠蛋白-血红蛋白)复合物。电泳完后可以利用血红蛋白的过氧化物酶活性在过氧化氢存在时使联苯胺氧化成联苯胺蓝，染色普通型可采用聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分型。Hp亚型则需先纯化样品中的Hp，再使Hp组分中的α肽链变性，还原后方能采用普通电泳或等电聚焦技术进行分型，操作过于复杂。因Hp在血痕中可以保存相当长的时间，在实践中可通过检测血痕中的Hp进行分型鉴定，但由于血痕中过多的血红蛋白可掩盖Hp泳谱，因而在一定程度上限制了血痕的个体识别能力。故有待提供一种操作简便快速、准确，又可应用于临床实践的检测结合珠蛋白分型的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术提供了一种检测结合珠蛋白分型的试剂盒，以至少解决现有技术中检测结合珠蛋白分型方法复杂、准确率低的技术问题。本专利技术提供了一种用于检测结合珠蛋白分型的试剂盒，上述试剂盒包括特定正向引物、特定反向引物及缓冲液；上述缓冲液的成分包括：三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，终浓度为8mmol/L-12mmol/L，pH为8.0-8.7；氯化钾(KCl)，终浓度为40mmol/L-60mmol/L；氯化镁(MgCl2)，终浓度为：1mmol/L-2mmol/L；Taq酶，终浓度为0.5U-2.5U；脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，终浓度为100umol/L-250umol/L；上述特定正向引物及上述特定反向引物为：正向(F):5’-ATAATACAGTTCGCGAGCTTCT-3’；反向(R):5’-GGGCAAGATACTCAACCTGTC-3’。可选的，上述缓冲液的成分包括：三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，终浓度为10mmol/L，pH为8.3；氯化钾(KCl)，终浓度为50mmol/L；氯化镁(MgCl2)，终浓度为：1.5mmol/L；Taq酶，终浓度为2U；脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，终浓度为200umol/L。可选的，上述缓冲液的成分包括：三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，终浓度为8mmol/L，pH为8.0；氯化钾(KCl)，终浓度为60mmol/L；氯化镁(MgCl2)，终浓度为：1.0mmol/L；Taq酶，终浓度为2.5U；脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，终浓度为110umol/L。可选的，上述缓冲液的成分包括：三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，终浓度为12mmol/L，pH为8.6；氯化钾(KCl)，终浓度为40mmol/L；氯化镁(MgCl2)，终浓度为：1.8mmol/L；Taq酶，终浓度为0.8U；脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，终浓度为250umol/L。可选的，使用上述试剂盒对包含上述结合珠蛋白基因的待测基因进行基因扩增得扩增产物，通过对上述扩增产物进行电泳检测即可确定上述待测基因的上述结合珠蛋白的基因型。可选的，上述基因扩增，即聚合酶链反应(PCR)包括如下步骤：在90℃至100℃的温度下预变性3-5分钟；在90℃至100℃的温度下变性30秒至50秒，在55℃至65℃的温度下退火20秒至40秒，在70℃至74℃的温度下延伸40秒至90秒，其中上述变性步骤、上述退火步骤以及上述延伸步骤为25至40个循环；然后在70℃至74℃的温度下终延伸3至10分钟；最后保持温度为3℃至10℃。可选的，上述基因扩增，即聚合酶链反应(PCR)包括如下步骤：在95℃的温度下预变性4分钟；在95℃的温度下变性40秒，在60℃的温度下退火30秒，在72℃的温度下延伸80秒，其中上述变性步骤、上述退火步骤以及上述延伸步骤为30个循环；然后在72℃的温度下终延伸3分钟；最后保持温度为4℃。可选的，上述基因扩增，即聚合酶链反应(PCR)包括如下步骤：在98℃的温度下预变性5分钟；在98℃的温度下变性35秒，在63℃的温度下退火22秒，在70℃的温度下延伸60秒，其中上述变性步骤、上述退火步骤以及上述延伸步骤为38个循环；然后在70℃的温度下终延伸8分钟；最后保持温度为3℃。可选的，上述基因扩增，即聚合酶链反应(PCR)包括如下步骤：在92℃的温度下预变性3分钟；在92℃的温度下变性48秒，在55℃的温度下退火40秒，在74℃的温度下延伸45秒，其中上述变性步骤、上述退火步骤以及上述延伸步骤为26个循环；然后在70℃的温度下终延伸10分钟；最后保持温度为8℃。任一上述的试剂盒在检测结合珠蛋白基因的基因分型中的应用。本专利技术申请建本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测结合珠蛋白分型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括特定正向引物、特定反向引物及缓冲液；所述缓冲液的成分包括：三羟甲基氨基甲烷(Tris‑HCl)，终浓度为8mmol/L‑12mmol/L，pH为8.0‑8.7；氯化钾(KCl)，终浓度为40mmol/L‑60mmol/L；氯化镁(MgCl2)，终浓度为：1mmol/L‑2mmol/L；Taq酶，终浓度为0.5U‑2.5U；脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，终浓度为100umol/L‑250umol/L；所述特定正向引物及所述特定反向引物为：正向(F):5’‑ATAATACAGTTCGCGAGCTTCT‑3’；反向(R):5’‑GGGCAAGATACTCAACCTGTC‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测结合珠蛋白分型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括特定正向引物、特定反向引物及缓冲液；所述缓冲液的成分包括：三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，终浓度为8mmol/L-12mmol/L，pH为8.0-8.7；氯化钾(KCl)，终浓度为40mmol/L-60mmol/L；氯化镁(MgCl2)，终浓度为：1mmol/L-2mmol/L；Taq酶，终浓度为0.5U-2.5U；脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，终浓度为100umol/L-250umol/L；所述特定正向引物及所述特定反向引物为：正向(F):5’-ATAATACAGTTCGCGAGCTTCT-3’；反向(R):5’-GGGCAAGATACTCAACCTGTC-3’。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述缓冲液的成分包括：三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，终浓度为10mmol/L，pH为8.3；氯化钾(KCl)，终浓度为50mmol/L；氯化镁(MgCl2)，终浓度为：1.5mmol/L；Taq酶，终浓度为2U；脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，终浓度为200umol/L。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述缓冲液的成分包括：三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，终浓度为8mmol/L，pH为8.0；氯化钾(KCl)，终浓度为60mmol/L；氯化镁(MgCl2)，终浓度为：1.0mmol/L；Taq酶，终浓度为2.5U；脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，终浓度为110umol/L。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述缓冲液的成分包括：三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，终浓度为12mmol/L，pH为8.6；氯化钾(KCl)，终浓度为40mmol/L；氯化镁(MgCl2)，终浓度为：1.8mmol/L；Taq酶，终浓度为0.8U；脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，终浓度为250umol/L。5.一种使用权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：王天泽，李敏，
申请(专利权)人：北京中科唯新生物医学研究所有限公司，北京唯新精准医学研究中心有限公司，深圳中科唯新生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11