一种生物转化甲醇代谢途径制造技术

本发明专利技术提供一种生物转化甲醇代谢途径，在大肠杆菌中人工构建甲醇的代谢途径，该途径简洁，只需两步即可进入大肠杆菌的中央代谢途径。并通过对其途径上的关键酶—甲醛裂合酶（formolase）进行了定向进化，通过全细胞催化得筛选得到了有益突变克隆子，提高了甲醛裂合酶的酶活，然后组装代谢途径上的相关基因，得到了甲醇利用工程菌，在以甲醇为唯一碳源的培养基中进行培养，并通过培养基的优化以及基因敲除等手段实现了甲醇的高效利用。

【技术实现步骤摘要】
一种生物转化甲醇代谢途径
本专利技术属于生物转化合成
，具体涉及一种生物转化甲醇代谢途径。
技术介绍
甲醇是最简单的一元醇，是无色无味的有酒精气味易挥发的液体，近年来，甲醇的产量逐年增加，2014年突破6500万吨。而甲醇的价格逐年降低。甲醇的产量增加，价格越来越便，而甲醇具很大的毒性，且容易吸水，不能喝汽油等燃料混合使用，在运输过程中也不能采用原有的石油管道运输，运输成本很高，所以将甲醇转换为更具价值的化合物。现在利用化学的方法将甲醇合成其他化合物，该方法耗能大，且对环境的污染严重。生物转化方法不仅环保高效，产物分离简单，而且成本低廉。虽然甲醇的生物转化可在外界进行，但缺乏利用甲醇生产代谢产物的工程微生物。自然界中甲基营养型细菌主要通过RuMP途径和Serine循环进行甲醇氧化，该途径代谢过程复杂，需要多种酶的参与，可移植性差，无法转移至模式菌株中导致其应用有限，不适合工业生产。因此，如何实现甲醇的生物转化是近几年来生物能源研究的热点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种生物转化甲醇代谢途径，在大肠杆菌中建立甲醇代谢途径：甲醇在甲醇脱氢酶(MDH)的作用下转化为甲醛，甲醛在甲醛裂合酶(FLS)的作用下生产1,3-二羟基丙酮（DHA），DHA可直接被大肠杆菌利用生长。该途径通过MDH和FLS两个酶即可进入大肠杆菌中央代谢，简洁快速的实现了甲醇的生物转化。而目前国内外尚无有关该途径的报道。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种生物转化甲醇代谢途径，其构建方法是将启动子、甲醇脱氢酶、甲醛裂合酶FLS连接在pET28a上并转入大肠杆菌E.coli(DH5α)中，在以甲醇为唯一碳源的M9培养基+1g/L酵母粉的培养基中培养。所述的启动子为J23100或J23106中的一种，其序列见SEQIDNO.1-2。所述的甲醇脱氢酶，其序列见SEQIDNO.3。所述的甲醛裂合酶FLS，其序列见SEQIDNO.4-9为中的一种。具体包括以下步骤：1）甲醛裂合酶的改造：利用软件对甲醛裂合酶进行分析，通过分子模拟，进行分子对接，预测活性中心以及底物通道上的热点突变位点，分别是Thr396,Thr446,Met473,Ser477,Leu482和Leu499，然后通过设计引物对相应位点氨基酸进行定点饱和突变。2）有益突变克隆子的筛选：将突变后的fls基因连接在载体pET28a上，在大肠杆菌中克隆表达。得到的菌株以甲醛为底物进行全细胞催化，与原始的FLS比较，催化效率更高的即为有益突变菌株，然后通过基因测序，找到相对应突变的位点及氨基酸。3）甲醛脱氢酶的敲除：甲醇通过脱氢酶会生成甲醛，甲醛在FLS的作用下生长DHA，同时甲醛在甲醛脱氢酶的作用下会进一步转化为二氧化碳。为了减少碳损失，使更多的碳流向中央代谢途径，敲掉甲醛代谢支路上的甲醛脱氢酶基因frmA。4）代谢途径相关基因的组装与培养通过BRENDA数据库（http://www.brenda-enzymes.org/）筛选了若干要求的酶，分别是甲醇脱氢酶BsMDH、组成型启动子(J23100,J23106),甲醛裂合酶(FLS)。委托通用生物系统（安徽）有限公司合成基因。然后将启动子J23100/J23106、甲醇脱氢酶、甲醛裂合酶FLS克隆在pET28a上并转入大肠杆菌E.coli(DH5α)中。在以甲醇为唯一碳源的M9培养基+酵母粉的培养基中培养。本专利提供一种利用甲醇的代谢途径，该途径简洁，只需两步就进入大肠杆菌中央代谢途径，实现甲醇在大肠杆菌的生物转化。经过组装筛选，在培养72h后，甲醇利用量达到了14.2mM。附图说明图1为甲醇通过人工途径在大肠杆菌中生长代谢图。图2为甲醛测定标准曲线。图3为甲醇测定标准曲线。图4为甲醇气相色谱检测图。图5为甲醛裂合酶酶活测定。图6为敲除甲醛脱氢酶后甲醛积累情况。图7为不同甲醛裂合酶组合下菌体生长情况与甲醇利用情况。图8为不同甲醛裂合酶组合下菌体生长情况与甲醇利用情况。具体实施方式为了使本专利技术所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本专利技术所述的技术方案做进一步的说明，但是本专利技术不仅限于此。1、培养方法1.1培养基种子培养基（g/L）：蛋白胨10、酵母粉5、氯化钠10（pH=7.0）。发酵培养基（g/L）：NaHPO4.12H2O17.1、KH2PO43、NaCl0.5、NH4Cl1MgSO40.12、CaCl20.01、Methanol3.2（pH=7.0）。1.2灭菌方法种子培养基和发酵培养基分别于121℃灭菌20min，接种前用4MNaOH将培养基pH调节至7.0。MgSO4和CaCl2需单独配置灭菌；甲醇不能高压灭菌，用过滤除菌的方法。1.3培养方法取-80℃冰箱保存的工程菌甘油管，将1mL菌液转接至装有30mL种子培养基的250mL三角瓶中，接种后的三角瓶置于30℃、180rpm摇床上培养12h，4℃，6000rpm离心手机菌体，用M9盐溶液清洗菌体两次，再用等量的M9盐溶液悬浮菌体，按5%的接种量接种至发酵培养基中，置于30℃、180rpm摇床上培养。2、分析方法2.1甲醛测定方法取1mL发酵液于10000rpm离心5min，取0.7mL上清液，加入至等量的Nash试剂，混合均匀。置于37℃水浴20min，测定其在600nm处的吸光度。2.2甲醛裂合酶酶活及动力学测定方法酶活测定：定义：一个酶活力单位(U)为每分钟所消耗1uM底物(甲醛)所需的酶量。体系(1mL):100mMKPO4缓冲液(pH=8.0)、1mMMgSO4、0.1mMTPP、20mM甲醛、1uM（0.03mg)纯酶。条件：30℃水浴反应1h后，适当稀释后加入等量的纳氏试剂，30℃水浴20min后在405nm下测定其吸光值，通过标准曲线得到甲醛的消耗量，最终得到酶活。动力学参数测定：体系(1mL):100mMKPO4缓冲液(pH=8.0)、1mMMgSO4、0.1mMTPP，底物浓度为1~20mM，1uM（0.03mg)纯酶。条件：30℃水浴反应1h后，适当稀释后加入等量的纳氏试剂，30℃水浴20min后在405nm下测定其吸光值，通过标准曲线得到甲醛的消耗量，最终得到酶活。2.3甲醇测定方法取1mL发酵液于4℃，10000rpm离心5min，取上清液。2.3.1发酵液预处理（1）称取1.5g无水碳酸钠，置于10mL离心管中，并加入2mL乙酸乙酯；（2）取1mL发酵液，8000rpm离心10min，取0.4mL上清液，在漩涡混合器上边振荡边加入上述离心管；（3）加样完毕将离心管在4℃下密封静置2h，之后将离心管于8000rpm离心10min；（4）取0.4mL上清液与0.4mL以乙酸乙酯为溶剂溶解的5g/L正丁醇混匀；（5）将混匀溶液置于4℃冰箱保存待测。2.3.2气相色谱检测发酵上清液经过萃取后，加入内标5g/L正丁醇从而来准确测定甲醇的浓度。本实验采用AgilentGC7820A气相色谱仪来测定，测定条件如下：柱温：50℃保留1.5min；升温速率：8℃/min程序升温到95℃；进样口温度：215℃；检测器温度：245℃；高纯空气流速：300mL/min；氮气流速：10mL/min；氢气流速：30mL/min；分流模式：分流出口流本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物转化甲醇代谢途径，其特征在于：其构建方法是将启动子、甲醇脱氢酶、甲醛裂合酶FLS克隆在pET28a上并转入大肠杆菌

【技术特征摘要】
1.一种生物转化甲醇代谢途径，其特征在于：其构建方法是将启动子、甲醇脱氢酶、甲醛裂合酶FLS克隆在pET28a上并转入大肠杆菌E.coli(DH5α)中，在以甲醇为唯一碳源的M9培养基+1g/L酵母粉的培养基中培养。2.根据权利要求1所述的一种生物转化甲醇代谢途径，其特征在于：所述的启动子为J23...

【专利技术属性】
技术研发人员：张燎原，何远志，郭泽望，高慧芳，杨天行，李立志，柳陈军，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建,35