一种烟草干旱响应基因NtTIFY及其克隆方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种烟草干旱响应基因

【技术实现步骤摘要】
一种烟草干旱响应基因NtTIFY及其克隆方法与应用
本专利技术属于遗传工程
，进一步属于涉及烟草抗旱响应的相关基因，具体涉及一种烟草干旱响应基因NtTIFY及其克隆方法与应用。
技术介绍
干旱严重影响作物的生长发育、产量及品质。提高植物的抗旱能力已经成为现代植物研究工作中的关键问题之一。抗旱机理的研究是抗旱育种的基础，也是育种的关键因素之一。经历了几十年的努力，对植物抗旱的研究已从抗旱指标的表观因素分析，进入到分子及基因水平的探索。近年来，随着全球气候变暖，干旱已成为我国作物生产中频繁发生的自然灾害。烟草作为中国重要的经济作物，在整个生育期对水分的要求很高。中国大部分烟区处于干旱、半干旱环境中，而且优质烟区多位于丘陵山区，常因土壤干旱而影响烟株的生长发育，导致烟叶的产量和品质降低，干旱已成为制约我国烟叶产量与品质提高的主要限制因子之一。因此，加强烟草抗旱基因资源的挖掘和利用，对于烟草抗旱新品种培育，实现烟草农业可持续发展具有重大意义。自20世纪80年代以来，国内外学者在干旱对烟草生长、发育、代谢的影响等方面做了大量研究，取得了一些重要进展。归纳起来主要有以下几个方面:第一，干旱对烟草生理的影响，主要表现在:(1)干旱胁迫影响了叶绿素的合成，促进了叶绿素的分解，从而影响了叶片的光合效率；(2)干旱胁迫导致植株氮素代谢关键酶-硝酸还原酶(NR)的活性降低，而蛋白水解酶活性增强引起脯氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和缬氨酸等大量积累；(3)干旱胁迫导致叶片膜脂过氧化作用增强，膜透性增加，丙二醛(MDA)含量升高，出现电解质外渗。抗氧化保护酶SOD、POD、CAT等酶活性显著下降。第二，干旱对烟草生长发育的影响，主要表现在:(1)干旱胁迫降低了种子的萌发和幼苗的成活；(2)抑制了根系的生长，从而影响了矿质营养的吸收；(3)干旱胁迫导致植株矮小，节间短，叶片小，易早衰。这些研究较好地阐明了干旱对烟草生长、发育及代谢影响的生理生化基础，但缺乏对烟草抗旱分子遗传机理的研究。近年来，随着分子生物学和基因组学研究的深入，发现茉莉酸（JA）参与到植物抗旱过程。向干旱胁迫的大豆外施50μmol/L的茉莉酸甲酯能够提高大豆的抗旱性。经JA处理后，SOD、POD、CAT等酶活性升高，膜脂过氧化性增高。JAZ家族是TIFY蛋白家族中的亚家族，该家族在JA信号转导中起到重要的作用。JAZ蛋白有转录抑制子的功能，而非JAZ蛋白的TIFY蛋白也有报道有抑制转录的作用；其中，TIFY家族基因OsJAZ能够通过JA途径调控OsbHLH148的表达，而在水稻中超过量表达OsbHLH148基因能够增强水稻的抗旱性。因此，本专利技术旨在提供一种基因水平上的烟草干旱响应基因，以增强烟草植株的抗旱性。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种烟草干旱响应基因NtTIFY，所述基因编码一种烟草响应多肽，所述多肽包含的氨基酸序列如SEQID：No.2所示。本专利技术的第二目的在于提供所述烟草干旱响应基因NtTIFY包含的核苷酸序列如SEQID：No.1所示。本专利技术的第三目的在于提供一种烟草干旱响应基因NtTIFY的克隆方法，所述方法包括以下步骤：（1）烟草叶片cDNA合成：提取烟草叶片总RNA，反转录得到第一链cDNA；（2）NtTIFY基因的PCR扩增：以烟草叶片cDNA为模板，根据NtTIFY基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。本专利技术的第四目的在于提供一种烟草干旱响应基因NtTIFY的应用，即抑制所述NtTIFY基因的表达，或对NtTIFY基因进行基因修饰、或基因编辑、或化学诱变、或物理诱变，使烟株表现为干旱不敏感。本专利技术的第五目的在于提供一种含有所述烟草干旱响应基因NtTIFY的重组载体。本专利技术的第六目的在于提供一种含有所述烟草干旱响应基因NtTIFY的表达盒。本专利技术的第七目的在于提供一种含有所述烟草干旱响应基因NtTIFY的转基因细胞系。本专利技术的第八目的在于提供一种含有权利所述烟草干旱响应基因NtTIFY的重组菌。附图说明图1烟草叶片中NtTIFY基因响应干旱胁迫柱状图；图2NtTIFY的PCR产物电泳图；图中，M-分子量标记；1-PCR产物。图3NtTIFY的RNAi片段PCR产物电泳图；图中，M-分子量标记；1-RNAi片段PCR产物。图4pDONR-Zeocin载体图；图5NtTIFY基因植物表达载体PB2GW7图；图6NtTIFY基因植物RNAi干扰载体pHellsgate12图；图7转NtTIFY基因过表达载体的烟草株系表达水平柱状图；图中，野生型-K326（对照）；OE-1-NtTIFY基因过表达烟草株系。图8转NtTIFY基因RNAi敲除载体的烟草株系表达水平柱状图；图中，野生型-K326（对照）；RNAi-1-NtTIFY基因RNAi干扰表达烟草株系。图9NtTIFY基因过量表达及RNAi敲除的烟草植株对干旱胁迫处理的生长表型。图中，野生型-K326（对照）；OE-1-NtTIFY基因过表达烟草株系；RNAi-1-NtTIFY基因RNAi干扰表达烟草株系。具体实施方式下面结合附图对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所作的任何变换或替换，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所述的一种烟草干旱响应基因NtTIFY编码一种烟草响应多肽，所述多肽包含的氨基酸序列如SEQID：No.2所示。所述多肽还可能为由SEQIDNo：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成，且具有响应干旱功能的衍生多肽。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。本专利技术所述植物抗旱基因NtTIFY包含的核苷酸序列如SEQID：No.1所示。或者在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；或者与序列表中SEQIDNo：1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本专利技术所述的烟草干旱响应基因NtTIFY的克隆方法包括以下步骤：（1）烟草叶片cDNA合成：提取烟草叶片总RNA，反转录得到第一链cDNA；（2）NtTIFY基因的PCR扩增：以烟草叶片cDNA为模板，根据NtTIFY基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。作为本专利技术的一种优选，所述引物为正向引物：5’-ATGGGCCTTTCACAGTATCCAAC-3’；反向引物：5’-TCACATAGGACAAGTATCTTC-3’。本专利技术所述烟草干旱响应基因NtTIFY的应用为在烟草植株体内抑制所述NtTIFY基因的表达，可增强烟草的抗旱性。抑制NtTIFY基因表达的方法包括植物病毒载体介导基因沉默，或农杆菌介导转化RNAi载体，或优化修改基因编码匡，或优化基因启动子。本专利技术所述的抑制基因表达的方法并不限于上述几种方法，只要能抑制NtTIFY表达即可。还可以利用基因修饰的方法修饰NtTIFY基因；或将NtTIFY进行基因编辑；或将该基因进行化学诱变、物理诱变，使得植物表现出干旱不敏感的现象。本专利技术的NtTIFY基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种抑制转本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种烟草干旱响应基因

【技术特征摘要】
1.一种烟草干旱响应基因NtTIFY，其特征在于，所述基因编码一种烟草响应多肽，所述多肽包含的氨基酸序列如SEQID：No.2所示。2.根据权利要求1所述烟草干旱响应基因NtTIFY，其特征在于，所述植物抗旱基因NtTIFY包含的核苷酸序列如SEQID：No.1所示。3.一种权利要求1或2任一所述烟草干旱响应基因NtTIFY的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）烟草叶片cDNA合成：提取烟草叶片总RNA，反转录得到第一链cDNA；（2）NtTIFY基因的PCR扩增：以烟草叶片cDNA为模板，根据NtTIFY基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。4.根据权利要求3所述烟草干旱响应基因NtTIFY的克隆方法，其特征在于，所述引物为正向引物：5’-ATGGG...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢贺，白戈，姚恒，杨大海，肖炳光，李永平，杨爱国，童文杰，张谊寒，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南,53