本发明专利技术属于生物医药领域，涉及微卫星不稳定性位点‑BAT26位点的检测引物、扩增体系及检测试剂盒。该引物序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示。采用本发明专利技术的引物进行高分辨率熔解曲线法‑HRM检测，具有很高的灵敏度和特异性。
【技术实现步骤摘要】
微卫星不稳定性位点-BAT26位点的检测引物、扩增体系及检测试剂盒
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种检测肿瘤细胞中微卫星稳定性的扩增体系及检测试剂盒。
技术介绍
结直肠癌(colorectalcancer，CRC)在世界范围内的恶性肿瘤疾病当中，发病率高居第4位，是一种常见恶性肿瘤，死亡率高居第2位，严重威胁着人类的健康与生活。结直肠癌的发病过程所表现出的许多特性与某些遗传学改变相关，为了使更多结肠癌患者得到更科学合理的治疗，探索相关遗传指标来判断患者的预后和化疗疗效、指导患者的个体化治疗一直是受推崇的主题。近年来，微卫星不稳定性(MSI)的相关临床和基础方面研究取得了较好的进展，对MSI状态与CRC的关系有了更深入的认识。例如高度微卫星不稳定(MSI-H)的结直肠癌患者较低度微卫星不稳定(MSI-L)和微卫星稳定(MSS)的患者具有更好的预后。目前，检测微卫星不稳定性状态的方法包括MMR蛋白免疫组化法、片段分析法、HRM法等。上述后两种均属于基于PCR技术的方法，其引物的选择均是对检测灵敏度有极其重要影响的因素。片段分析法是目前公认的金标准方法，但该方法成本较高，检测时间较长，并且必须在价格昂贵的测序仪上进行分析。HRM法则具有快速、成本低、灵敏度高等优点，同时只需在荧光定量PCR仪上即可进行分析。但HRM法对引物设计的要求很高：引物既要有很好的特异性，又要求其扩增出的片段足够短，才能对其突变样本获得较好的分辨能力。BAT26位点是微卫星不稳定性检测的重要位点之一，但目前对其进行HRM法检测的研究很少，仅有一篇报导(RamunasJanavicius，2010)曾尝试使用HRM方法检测结直肠癌标本中BAT25、BAT26两个位点的检测，但检测例数不多，缺少大样本的临床验证。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种针对微卫星不稳定性位点-BAT26位点进行HRM法检测的引物/扩增体系/检测试剂盒。专利技术通过以下技术方案实现：首先，专利技术提供了一种引物，其序列选自SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。SEQIDNO.1:TGCAGCAGTCAGAGCCCTTASEQIDNO.2:GCTTCTTCAGTATATGTCAATGAAAACA本专利技术提供了一种针对BAT26位点进行HRM法检测的试剂盒，含有如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2所示引物。在该试剂盒中，各组分的用量配比如下(总体积20-25μL的扩增体系)：组分用量(μL)10×Buffer2-2.5dNTP2-2.5EvaGreen1-1.25SEQIDNO:1引物1-1.25SEQIDNO:2引物1-1.25Taq酶0.2-0.25无酶水11.8-15DNA模板1-5优选地，该试剂盒还含有EvaGreen。优选地，还含有dNTP。优选地，还含有Taq酶。更优选地，还含有缓冲溶液。采用上述的引物/扩增体系/检测试剂盒，可以对BAT26位点进行MSI检测，获得很好的敏感性和特异性。具体的，可以采用如下方法：1.信号收集：配制上述扩增体系，分别加入50-100ng结直肠癌患者肿瘤和正常组织的DNA模板，将含有标本的扩增体系放入RocheLightCycler480Ⅱ荧光定量PCR仪中进行检测，程序如下：95℃10min→(95℃20s→58℃20s→72℃20s)40cycles→熔解温度(70-83℃)，收集信号频率为12次/℃。2.结果分析：将肿瘤组织的熔解曲线与正常组织的熔解曲线进行对比，若肿瘤组织的熔解曲线显示出两个及以上的熔解峰，而该病人正常组织的熔解曲线仅显示出一个熔解峰，则判断两者的峰型不一致，表示该患者BAT26位点不稳定，从而判断该患者为微卫星不稳定(MSI)型患者。反之，则表示该患者BAT26位点稳定，但需结合其他位点的信息方可判断患者的MSI状态。作为示例，以本专利技术方法检测BAT26位点不稳定的样本，其检测结果如图1所示，肿瘤组织的熔解曲线与正常组织的熔解曲线不同；以本专利技术方法检测BAT26位点稳定的样本，其检测结果如图2所示，肿瘤组织的熔解曲线与正常组织的熔解曲线均为单峰。本专利技术经过多次探索发现，采用本专利技术的引物进行HRM法检测BAT26位点的稳定性，通过与Promega公司的MSI片段分析法(金标准方法)试剂盒检测结果比较，本专利专利技术方法灵敏度为100％，特异性达到97.67％。本专利技术操作程序大大简化，每检测一个样本的时间相较片段分析法缩短了约1小时，且HRM法成本大大降低(降低80％)。另外，HRM法无需使用基因分析仪，只需一台带有HRM功能的荧光定量PCR即可。附图说明图1为肿瘤组织的熔解曲线显示出两个熔解峰，对应正常组织的熔解曲线仅显示出一个熔解峰的结果示例。图2为肿瘤组织和对应正常组织的熔解曲线均只显示出一个熔解峰的结果示例。图3为肿瘤组织和对应正常组织的熔解曲线均显示出几个熔解峰结果示例。图4为HRM法无扩增引物的结果示例。具体实施方式以下通过具体的实施例进一步说明本专利技术的技术方案，具体实施例不代表对本专利技术保护范围的限制。其他人根据本专利技术理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本专利技术的保护范围。实施例1.微卫星不稳定性位点-BAT26位点的检测方法1.使用BlendTaqPlus酶(Toyobo，CATNO.BTQ-201)配置如下反应体系组分用量(μL)10×Buffer2.5dNTP2.5EvaGreen1.25SEQIDNO:1引物1.25SEQIDNO:2引物1.25Taq酶0.25无酶水152.将结直肠癌患者肿瘤组织和正常组织的DNA模板浓度调整至50-100ng/ul。在上述体系中分别加入1ul的DNA模板。上述结直肠癌患者肿瘤组织来源：中山大学附属第六医院手术切除肿瘤标本制备的石蜡切片。结直肠癌患者的正常组织来源：中山大学附属第六医院手术切除瘤旁远端正常组织制备的石蜡切片。3.涡旋混匀后，使用RocheLightCycler480Ⅱ荧光定量PCR仪进行检测，程序如下：95℃10min→(95℃20s→58℃20s→72℃20s)40cycles→熔解温度(70-83℃)，收集信号频率为12次/℃。4.将同一患者的肿瘤组织的熔解曲线与正常组织的熔解曲线进行对比，判读待测标本BAT26位点的稳定性。实施例2.不同引物对的结果对比在实验过程中专利技术人摸索了多组引物组合对实验结果的影响。实验证明，引物组合决定了方法的可行性。以下为采用多组示例性引物以实施例1方法进行实验所得结果(表1)。表1.摸索过程采用的6对引物组合及其产生峰型、判读结果比较注：本HRM检测法，其PCR程序总共设置40个循环。样品扩增CT值为18-25为宜，若样品扩增CT值不在该范围内，则判读为该次PCR反应无法扩增或扩增效果不好，最后有可能会影响扩增产物的量和后续的HRM分析。上述结果图谱仅示例性地显示出其中一部分。其余图谱未直接示出。结果显示，该例肿瘤患者使用商品化试剂盒检测判读为BAT26位点不稳定，使用上述六对引物，分别进行本专利技术所述HRM法进行检测。发现只有SEQIDNO:1、SEQIDNO:2所示引物(即上列表中一引物对1)可以准确判读该例患者BAT26位点不稳定，其余五对引物(即上列表中引物对2-6)均无法准确本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种引物，其特征在于序列选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
【技术特征摘要】
1.一种引物，其特征在于序列选自SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。2.一种扩增体系，其特征在于含有如权利要求1所述的引物。3.如权利要求2所述的扩增体系，其特征在于还含有EvaGreen。4.如权利要求2所述的扩增体系，其特征在于含有如下体积比的组分：10×Buffer:dNTP:EvaGreen:SEQIDNO:1引物:SEQIDNO:2引物:Taq酶:无酶水＝2-2.5:2-2.5:1-1.25:1-1.25:1-1.25:0.2-0.25:12-15。5.一种针对微卫星不稳定性位点-BAT26位点进行检测的试剂盒，其特征在于含有如权利要求1所述的引物。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于其系使用HRM法...
【专利技术属性】
技术研发人员：傅新晖，黄京林，陈志婷，林汉杰，王婧璇，王磊，汪建平，
申请(专利权)人：汪建平，王磊，傅新晖，黄京林，陈志婷，林汉杰，王婧璇，
类型：发明
国别省市：广东,44
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