一种抗肿瘤环肽及其制备方法和医药应用技术

一种抗肿瘤环肽及其制备方法和医药应用，属于生物制药领域。抗肿瘤环肽，其氨基酸序列为

An antitumor cyclic peptide and its preparation and medical application

An antitumor cyclic peptide, a preparation method and a medical application, belong to the field of biological pharmaceuticals. Antineoplastic cyclic peptide, its amino acid sequence is

【技术实现步骤摘要】
一种抗肿瘤环肽及其制备方法和医药应用
本专利技术属于生物制药领域，具体涉及一种抗肿瘤环肽及其制备方法和医药应用。
技术介绍
近年来，利用现代生物技术合成的多肽药物已成为药物研发的热点之一，其因适应证广、安全性高且疗效显著，目前已应用于肿瘤等相关重大疾病的预防、诊断和治疗，具有广阔的开发前景。随着多肽药物成为研发现代药物不可或缺的重要领域之一，其发展也越来越快。目前已经有超过300种多肽药物进入临床试验阶段，有超过600种多肽药物正在临床前试验中，并有超过60种多肽药物上市，包括用于治疗肿瘤的多肽药物，如用于治疗可切除的骨髓瘤的Mepect、用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤的Istodax和用于治疗CD30阳性霍奇金淋巴瘤的Adcetris等。多肽药物分子结构小、易改造、易合成，且生产过程中排放的废物少，属于绿色制药，因此多肽药物是21世纪最有发展前途的药物之一。
技术实现思路
本专利技术提供了一种抗肿瘤环肽，所述抗肿瘤环肽的氨基酸序列为其中两个Cys形成二硫键。该抗肿瘤环肽的分子量为1442.71，可以通过反相高效液相色谱法进行纯化，并且通过该方式纯化可以使其纯度达到96.78％。本专利技术提供了一种抗肿瘤组合物，所述抗肿瘤组合物包含本专利技术所述的抗肿瘤环肽。本专利技术进一步公开了所述抗肿瘤环肽的制备方法，所本专利技术采用固相合成法来制备所述抗肿瘤环肽。所述固相合成法可通过以下措施达到：采取Fmoc方案，选取CTC高分子树脂，将所述抗肿瘤环肽C端即羧基端的Fmoc-Gly-OH以共价键形式连接到CTC树脂上，脱掉Fmoc保护基团，以结合在高分子树脂上的Gly的氨基作为合成起点，按照所述抗肿瘤环肽从C端即羧基端到N端即氨基端的氨基酸序列CGHFKFGYLRCG的顺序，分别依次进行缩合反应形成肽键，脱Fmoc保护，缩合形成肽键，不断重复循环这个步骤，直到序列全部偶联完全，脱Fmoc保护；之后，用甲醇切割树脂得到多肽粗品，利用反相高效液相色谱法进一步纯化，经过处理使两个Cys形成二硫键成环；再用反相高效液相色谱法纯化得到纯度高达96.78％的目标环肽。本专利技术提供了所述抗肿瘤环肽在制备抗肿瘤药物中的应用。所述肿瘤选自肝癌、宫颈癌以及肺癌。所述抗肿瘤环肽在5-500μM浓度范围内对肝癌细胞HepG-2和宫颈癌细胞Hela的增殖抑制率分别为2.6％-100％和3.9％-99.9％，所述抗肿瘤环肽在9-900μM浓度范围内对肺癌细胞A549的增殖抑制率为16.5％-99.3％，其IC50值分别为36.90μM,61.41μM,39.87μM。本专利技术提供了所述抗肿瘤环肽在制备用于促进肿瘤细胞凋亡药物中的应用。在一个实施方案中，所述肿瘤细胞选自肝癌细胞、宫颈癌细胞以及肺癌细胞。在一个实施方案中，所述肿瘤细胞为肺癌细胞。所述抗肿瘤环肽浓度为40μM时，对肺癌细胞A549的促凋亡率为40.49％。与现有技术相比，本专利技术具有以下的优点和技术效果：本专利技术首次合成了该抗肿瘤环肽，并且采用CCK-8方法测定了该环肽的抗肿瘤活性，所述抗肿瘤环肽具有显著的抑制肿瘤细胞增殖的能力。此外，本专利技术人还采用流式细胞技术检测了该环肽对肿瘤细胞的促凋亡作用，结果发现，所述抗肿瘤环肽对肿瘤细胞具有显著的促凋亡作用。附图说明图1抗肿瘤环肽的HPLC图。图2抗肿瘤环肽的MS图。图3浓度为40μM的本专利技术抗肿瘤环肽对肺癌细胞A549的促细胞凋亡检测图。具体实施方式本专利技术的具体实施方式结合以下实施例来说明，但本专利技术并不限于以下实施例。实施例1抗肿瘤环肽的固相合成在本专利技术所述的抗肿瘤环肽的固相合成过程中，采用Fmoc方案，选取CTC树脂，进行处理使树脂暴露出活性位点，将Fmoc-Gly-OH以共价键形式连接到CTC树脂上，用DMF洗涤树脂。再加入体积浓度为25％哌啶/DMF溶液脱掉Fmoc保护基团。利用标准的固相合成过程(SPPS)，加入HBTU、N-甲基吗啉和Fmoc-Cys(Trt)-OH，使Fmoc-Cys(Trt)-OH与已经连接在CTC树脂上的Gly发生脱水缩合反应通过肽键连接在一起，茚三酮检测反应是否完全。再加入体积浓度为25％哌啶/DMF溶液脱掉Fmoc保护基团；采用上述步骤，按照氨基酸序列CGHFKFGYLRCG的顺序依次连接上去，直到序列全部偶联完全，脱掉Fmoc保护。树脂用甲醇洗涤待切割。将树脂转移到切割管中，加入现有技术中包括TFA、H2O、苯酚、EDT、苯甲硫醚等一种溶液或几种溶液的混合溶液，乙醚沉淀，切割完树脂得多肽粗品。利用反相高效液相色谱法进一步纯化，然后溶于纯水中，将1％的I2/MeOH溶液(1gI2溶解于100ml的MeOH中)缓慢滴加到溶液中，使两个Cys形成二硫键成环。用二氯甲烷萃取水溶液，用反相高效液相色谱法纯化得到纯度为96.78％的抗肿瘤环肽。实施例2采用CCK-8法测定环肽对肝癌细胞HepG-2、宫颈癌细胞Hela和肺癌细胞A549增殖的抑制作用将肝癌细胞HepG-2细胞悬液(1.5×104个/mL)、宫颈癌细胞Hela细胞悬液(2×104个/mL)以及肺癌细胞A549细胞悬液(2×104个/mL)按照每孔200μL的体积分别加入96孔板内，于37℃恒温CO2培养箱培养。24h之后细胞贴壁生长，吸出旧的培养液，将抗肿瘤环肽按照表1和表2的浓度分别配制成为5-500μM和9-900μM的药液，分别加入相应的96孔板内，并设置阴性对照和空白对照，于37℃恒温CO2培养箱孵育。48h后，吸出药液，加入配制好的CCK-8溶液，继续于37℃恒温CO2培养箱培养。2h后，在酶标仪上测其在450nm波长处的吸光度值。由表1可知，抗肿瘤环肽在5-500μM浓度的作用下，对肝癌细胞HepG-2的体外抑制率为2.6％-100％，其IC50值为36.90μM，对宫颈癌细胞Hela的抑制率为3.9％-99.9％，其IC50值为61.41μM。由表2可知，抗肿瘤环肽在9-900μM浓度的作用下，对肺癌细胞A549的抑制率为16.5％-99.3％，其IC50值为39.87μM。表1抗肿瘤环肽对肿瘤细胞HepG-2和Hela细胞增殖的抑制作用表2抗肿瘤环肽对肿瘤细胞A549增殖的抑制作用实施例3采用流式细胞法检测环肽对肺癌细胞A549的促凋亡作用选取肺癌细胞A549作为研究对象，检测本环肽对肿瘤细胞的促凋亡作用。将对数生长期的肺癌细胞A549细胞悬液(1.75×104个/mL)按照每孔2mL的体积加入6孔板内，于37℃恒温CO2培养箱培养。24h后细胞贴壁生长，加入终浓度为40μM的抗肿瘤环肽药液，设置不加药只加培养基和细胞的阴性对照，和加药FITC/PI单染的阳性对照，于37℃恒温CO2培养箱培养。48h后，小心处理细胞培养液到离心管内备用，用不含EDTA的胰酶消化细胞，加入前面收集的培养液小心吹打细胞。离心沉淀细胞，用4℃预冷的PBS洗涤细胞，再次离心沉淀细胞。用配制好浓度的结合缓冲液重悬细胞，调节其浓度为1-5×106/mL。取100μL的细胞悬液于5mL流式管中，加入AnnexinV/FITC混匀后于室温避光孵育5min，加入碘化丙啶溶液(PI)和PBS，在流式细胞仪上进行流式检测。检测结果如图3所示，从该图中可以看出，本环肽对肺癌细胞A549有促凋亡作本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗肿瘤环肽，其特征在于，所述抗肿瘤环肽的氨基酸序列为

【技术特征摘要】
1.一种抗肿瘤环肽，其特征在于，所述抗肿瘤环肽的氨基酸序列为其中两个Cys形成二硫键。2.一种抗肿瘤组合物，其特征在于，所述抗肿瘤组合物包含权利要求1所述的抗肿瘤环肽。3.一种制备权利要求1所述抗肿瘤环肽的制备方法，其特征在于，采用固相合成法来制备所述抗肿瘤环肽。4.权利要求1所述的抗肿瘤环肽作为制备抗肿瘤药...

【专利技术属性】
技术研发人员：张娜，唐珊，汪杨俊琦，齐晓倩，赵丽娇，钟儒刚，
申请(专利权)人：北京工业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11