检测RB1基因I680T位点突变的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及检测RB1基因I680T位点突变的试剂盒，包括：检测RB1基因I680T位点突变的特异性引物，所述特异引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述特异引物的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术首次揭示了RB1基因I680T位点突变与接受辅助性化疗的非小细胞肺癌患者预后之间的关系，并根据该发现设计出检测试剂盒，为非小细胞肺癌患者辅助性化疗方案的选择提供了个体化指导。

【技术实现步骤摘要】
检测RB1基因I680T位点突变的试剂盒
本专利技术涉及一种检测RB1基因I680T位点突变的试剂盒，属于生物技术和医学

技术介绍
RB1是一种抑癌基因，因该基因与视网膜母细胞瘤的发生密切相关，因此被命名为视网膜母细胞瘤基因。人类RB1基因全长178143bp，定位于13号染色体长臂(13q14.2)，编码928个氨基酸。RB1通过调控细胞周期、细胞分化、细胞凋亡以及生长抑制，对包括视网膜母细胞瘤、骨肉瘤、胰腺癌、乳腺癌和小细胞癌等在内的恶性肿瘤发挥着重要的抑制作用。研究表明，在非小细胞肺癌中通过抑制RB1的表达可以促进肿瘤细胞的侵袭和转移。在晚期肺鳞状细胞癌患者中，RB1的突变与铂类联合紫杉醇化疗方案的疗效密切相关，并且RB1的突变也被确定为独立的预后指标。Taqman探针是一种在Real-timePCR技术平台发展出来的荧光检测技术，是在PCR扩增时加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。在探针的5’端标记有荧光报告基团如FAM、VIC等，在探针的3’端标记荧光淬灭基团。当探针完整时，淬灭基团会吸收报告基团发射的荧光信号，当进行PCR扩增时，与模板结合的探针会遇到TaqDNA聚合酶，探针就会被TaqDNA聚合酶的5’端到3’端的外切酶活性酶切降解，导致报告基团和淬灭基团分离，从而发出荧光信号，达到PCR产物形成与荧光信号的积累完全同步。目前急需解决的问题是研究一种能够快速检测非小细胞肺癌患者RB1基因I680T(c.2039T>C)位点突变的方法，从而为非小细胞肺癌患者个体化的辅助性化疗提供依据。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种快速、准确、廉价的检测RB1基因I680T(c.2039T>C)位点突变的试剂盒。专利技术概述专利技术人采用二代高通量测序技术检测到RB1基因I680T(c.2039T>C)位点的突变，并发现该位点突变与接受辅助性化疗的肺癌患者的预后之间的关系。当该位点核苷酸为T时，IIBorIIIA期非小细胞肺癌患者术后接受卡铂联合多西他赛方案或者卡铂联合长春瑞滨方案，患者的无病生存期(DFS)以及总生存期(OS)无统计学差异；当该位点核苷酸为C时，术后接受卡铂联合多西他赛化疗方案的IIBorIIIA期非小细胞肺癌患者相比于接受卡铂联合长春瑞滨方案的患者的DFS和OS显著延长。根据该发现，专利技术人采用实时荧光定量PCR检测方法，设计出一种检测RB1基因I680T(c.2039T>C)突变位点的试剂盒，该试剂盒具有检测快速、准确、成本相对廉价且操作简便的特点。专利技术详述检测RB1基因I680T(c.2039T>C)位点突变的试剂盒，包括：检测RB1基因I680T(c.2039T>C)位点突变的特异性引物，所述特异性引物的上游核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述特异引物的下游核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。根据本专利技术优选的，上述试剂盒，还包括：特异性识别RB1基因I680T(c.2039T>C)突变位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型核苷酸序列如SEQIDNO.3所述，Taqman探针的突变型核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；根据本专利技术优选的，上述试剂盒，还包括：缓冲液，dNTPs，TaqDNA聚合酶，MgCl2和DNA提取试剂盒。根据本专利技术优选的，上述试剂盒，反应在20μL体系中进行，各成分反应浓度如下：上游引物0.2μM、下游引物0.2μM、野生型Taqman探针0.1μM、突变型Taqman探针0.1μM、dNTPs0.25mM、TaqDNA聚合酶0.025U/μL、MgCl21.5mM、DNA提取试剂盒提取到的模板DNA<250ng。根据本专利技术优选的，所述Taqman探针野生型的5′端连接VIC荧光标记；Taqman探针突变型的5′端连接FAM荧光标记。有益效果1、本专利技术首次揭示了RB1基因I680T(c.2039T>C)位点突变与接受辅助性化疗的非小细胞肺癌患者的预后之间的关系，并根据该发现设计出检测RB1基因该位点突变的试剂盒，从而为非小细胞肺癌患者个体化的辅助性化疗提供指导；2、本专利技术所述的试剂盒采用实时荧光定量PCR技术对RB1基因I680T(c.2039T>C)突变位点进行检测，该试剂盒实用范围广，可以检测从石蜡切片、新鲜组织以及外周血中提取的DNA，较现有二代高通量测序技术操作简单、时间短、价格低廉。附图说明图1是用本专利技术所述试剂盒检测RB1基因I680T(c.2039T>C)位点野生型的检测结果；图中：虚线为野生型探针5′端上VIC基团所发荧光；图2是用本专利技术所述试剂盒检测RB1基因I680T(c.2039T>C)位点突变型的检测结果；图中：实线为突变型探针5′端上FAM基团所发荧光。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案做进一步阐述，但本专利技术所保护范围不限于此。实施例中DNA提取试剂盒包括：GeneReadTMDNAFFPEKit购自QIAGEN公司；TIANampGenomicDNAKit购自TIANGEN公司。TaqDNA聚合酶等其他试剂均购自大连宝生物公司。实施例1专利技术人采用二代高通量测序技术检测到RB1基因I680T(c.2039T>C)位点的突变，并发现该位点突变与接受辅助性化疗的肺癌患者的预后之间的关系。当该位点核苷酸为T时，IIBorIIIA期非小细胞肺癌患者术后接受卡铂联合多西他赛方案或者卡铂联合长春瑞滨方案，患者的无病生存期disease-freesurvival(DFS)以及总生存期overallsurvival(OS)无统计学差异；当该位点核苷酸为C时，术后接受卡铂联合多西他赛化疗方案的IIBorIIIA期非小细胞肺癌患者相比于接受卡铂联合长春瑞滨方案的患者的DFS和OS显著延长。具体研究过程如下：入组病例：专利技术人回顾性地调查了从2010年2月至2012年7月在山大二院就诊的非小细胞肺癌患者，按照剔除标准，最终确定一批IIBorIIIA期非小细胞肺癌入组本研究，入组肺癌患者术后均接受了辅助性化疗，方案为卡铂联合多西他赛或者长春瑞滨，入组肺癌患者均有明确的临床病理特征和完整的术后随访信息。研究方法：采用二代高通量测序技术对上述肿瘤组织进行基因测序，步骤包括：①使用GeneReadTMDNAFFPEKit提取石蜡切片样本中的DNA并定量；②IonAmpliSeqTM文库准备；③IonPGMTMHi-QTM测序及数据处理；研究结果：在47.2％的病人中检测到了RB1基因I680T(c.2039T>C)位点突变，专利技术人通过Kaplan-Meier分析法发现在所有检测到RB1基因该位点突变的肺癌病人中，卡铂联合多西他赛化疗方案相比卡铂联合长春瑞滨化疗方案能显著延长患者的无病生存期(DFS)和总生存期(OS)；根据Cox回归模型，在检测搭配RB1基因该位点突变的肺癌患者中，卡铂联合多西他赛化疗方案是影响预后的独立指标。但是在RB1基因该位点为野生型的肺癌患者中，卡铂联合多西他赛化疗方案与卡铂联合长春瑞滨化疗方案对患者预后的影响无统计学差异。研究结论：在RB1基因I680T(c.203本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测RB1基因I680T(c.2039T>C)位点突变的试剂盒，其特征在于，包括：检测RB1基因I680T(c.2039T>C)位点突变的特异性引物，所述特异性引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述特异引物的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.检测RB1基因I680T(c.2039T>C)位点突变的试剂盒，其特征在于，包括：检测RB1基因I680T(c.2039T>C)位点突变的特异性引物，所述特异性引物的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述特异引物的下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括：特异性识别RB1基因I680T(c.2039T>C)位点突变的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型核苷酸序列如SEQIDNO.3所述，Taqman探针的突变型核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。3.如权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵小刚，李培超，王文娟，唐东起，
申请(专利权)人：赵小刚，
类型：发明
国别省市：山东,37