基于自淬灭探针熔解曲线的ALDH2基因多态性检测试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种ALDH2基因c.1510位点多态性检测的试剂盒及检测方法，本发明专利技术设计了针对ALDH2基因位点特异的引物和探针：上游引物F：5’‑TGGTGGCTACAAGATGTCG‑3’；下游引物R：5’‑GCAGACCCTCAAGCCCCAAC‑3’；荧光标记探针P：5’‑FAM‑T*G*C*AGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTG‑BHQ1‑3’本发明专利技术试剂盒具有敏感性高、特异性好、反应快速且成本低的优势，适合于大规模临床开展；可以实现对ALDH2的快速、有效且准确的分型定性检测，为硝酸甘油治疗心绞痛的及时治疗、饮酒指导、相关癌症的发生提供参考。

【技术实现步骤摘要】
基于自淬灭探针熔解曲线的ALDH2基因多态性检测试剂盒及方法(一)
本专利技术涉及一种基于自淬灭探针熔解曲线的ALDH2基因多态性检测试剂盒以及检测方法。(二)
技术介绍
人乙醛脱氢酶2(ALDH2)是酒精代谢的关键酶，其编码基因ALDH2具有高度的多态性。ALDH2基因*2多态性(NM_000690.3:c.1510G>A,p.Glu504Lys)可导致乙醛脱氢酶酶活性显著降低，乙醛代谢成乙酸速度较慢，导致饮酒后体内乙醛的堆积。当血液中乙醛达到一定浓度时，会出现面红、头痛、心动过速、呼吸苦难等不适，表现为对酒精的不耐受性，称为面红反应。尤其是ALDH2*2/ALDH2*2基因型(纯合突变型)的饮酒者血液中乙醛的浓度是ALDH2*1/ALDH2*1(纯合野生型)的19倍，对酒敏感，没有耐受性，饮酒后很快出现严重不适现象。大量乙醛滞留在体内，除了损伤肝脏导致脂肪肝、肝硬化、甚至肝癌，还与增加食道癌、口咽癌和胃癌、冠心病、心肌梗死等风险相关，严重影响身体健康。在亚洲的黄种人群中，ALDH2是频率最高且最重要的突变型。在中国人中，约30％～50％的人为ALDH2基因异常人群。ALDH2基因多态性不仅与酒精在人体内的分解代谢有关，还参与硝酸甘油的代谢。舌下含服硝酸甘油片是抗冠心病心绞痛急性发作的常规首选方法，但该药的临床有效性常因人而异，有些患者服用之后并无疗效。研究发现，人体内的ALDH2具有硝酸酯酶活性，是硝酸甘油的有效代谢物一氧化氮形成的关键，如果病人基因中携带有ALDH2突变，乙醛脱氢酶2的硝酸酯酶活性会降低10倍以上，使硝酸甘油无法产生一氧化氮，难以发挥药效。因此，检测ALDH2基因型为医生合理使用硝酸甘油提供有力参考，减少用药无效导致的意外死亡。综上所述，ALDH2基因多态性检测将为硝酸甘油的用药、饮酒指导及相关高风险疾病的指示提供有效的参考依据，具有重要的临床应用意义。目前，用于ALDH2基因分型的方法主要有以下几种，各有其特点。1、单链构象多态性技术(PCR-SSCP)利用点突变或SNP可以对短的DNA单链构象造成影响，从而导致电泳速度的不同来进行检测。特点是可以进行特定区域突变的筛查，但需要跑PAGE胶，较为繁琐，并有一定的漏检率。2、限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术(PCR-RFLP)根据突变或SNP位点选择合适的内切酶对PCR产物进行酶切，然后电泳鉴定。该方法稳定可靠，但要注意酶切效率完全，而且不是所有的突变或SNP位点都有酶可以选择，容易造成污染。3、等位基因特异性PCR(allelespecificPCR，AS-PCR)利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，从而检测出突变。利用Taqman探针在实时荧光定量PCR平台上实现对样品DNA中突变的检测，具有极高的特异性和敏感度。4、Taqman探针法(定量PCR)适合已知SNP位点、位点数量少、通量高的检测。但是探针合成费用价格昂贵，不能同时发现未知SNP位点，并且容易造成假阳性结果。5、高分辨率熔解曲线法(HRM)原理简单，不需要对反应条件和体系进行特别的优化，容易实现，可进行突变的筛查，但需要特定仪器和试剂的支持。并且只能对片段内突变点进行检测，不能确定检测突变点的具体位置，容易造成假阳性结果。6、直接测序法(Sanger法)SNP分析的金标准，由于基因序列分析法检测的是易突变区的完整序列，因此可以检测未知突变位点。但测序实验操作较为复杂、实验周期较长、电泳容易造成实验室污染。7、变性高效液相色谱法(DHPLC)对于特定位点的突变检测，需要摸索各种条件，稳定性较差，影响因素太多，所以不容易做好8、芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化、防污染等特点，仅适用于全基因组SNP扫描，不适宜单个基因的SNP位点检测，精度低，价格昂贵。上述几种方法均存在一定的缺陷，有待进一步改进和发展。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种特异性好，灵敏度高，价格低廉，操作简便，通过仪器读取的Tm值即可直观明了地判读结果，基于自淬灭探针熔解曲线法检测ALDH2基因多态性的试剂盒和方法。本专利技术采用的技术方案是：一种基于自淬灭探针熔解曲线的ALDH2基因多态性检测试剂盒，主要包括ALDH2特异性扩增引物和荧光标记探针，以及DNA提取试剂和PCR反应试剂；所述ALDH2特异性扩增引物序列如下：上游引物F：5’-TGGTGGCTACAAGATGTCG-3’；下游引物R：5’-GCAGACCCTCAAGCCCCAAC-3’；荧光标记探针P：5’-FAM-T*G*C*AGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTG-BHQ1-3’；其中*标记碱基为硫代修饰。本专利技术的关键在于特异性扩增引物和荧光标记探针，试剂盒中所用的其他试剂，即DNA提取试剂和PCR反应试剂，本领域普通技术人员可根据实际需要进行选择和调整。为保证试剂盒检测结果的准确性，所述试剂盒还包括强/弱杂合型阳性质粒和阴性对照品。所述强/弱杂合型阳性质粒由突变纯合型阳性质粒和野生纯合型阳性质粒等比例混合而成；突变纯合型阳性质粒序列如SEQIDNo.1所示：GGCAACAGAGAAAGATTCTATCTCAAAAAAAAAAATTTTTTTTTAAGTTAAAAATAAAATAAAGACTTTGGGGCAATACAGGGGGTCCTGGGAGTGTAACCCATAACCCCCAAGAGTGATTTCTGCAATCTCGTTTCAAATTACAGGGTCAACTGCTATGATGTGTTTGGAGCCCAGTCACCCTTTGGTGGCTACAAGATGTCGGGGAGTGGCCGGGAGTTGGGCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTAAAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACCTGCTGGGGGCTCAGGGCCTGTTGGGGCTTGAGGGTCTGCTGGTGGCTCGGAGCCTGCTGGGGGATTGGGGTCTGTTGGGGGCTCGGGGCCTGCCAGAGGTTCAGGACCTGCCGGGGACTCAGGGCCTGCTGGAAGTTCAGGACCTGCTGG。野生纯合型阳性质粒序列如SEQIDNo.2所示：GGCAACAGAGAAAGATTCTATCTCAAAAAAAAAAATTTTTTTTTAAGTTAAAAATAAAATAAAGACTTTGGGGCAATACAGGGGGTCCTGGGAGTGTAACCCATAACCCCCAAGAGTGATTTCTGCAATCTCGTTTCAAATTACAGGGTCAACTGCTATGATGTGTTTGGAGCCCAGTCACCCTTTGGTGGCTACAAGATGTCGGGGAGTGGCCGGGAGTTGGGCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACCTGCTGGGGGCTCAGGGCCTGTTGGGGCTTGAGGGTCTGCTGGTGGCTCGGAGCCTGCTGGGGGATTGGGGTCTGTTGGGGGCT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于自淬灭探针熔解曲线的人乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因多态性检测试剂盒，主要包括ALDH2特异性扩增引物和荧光标记探针，以及DNA提取试剂和PCR反应试剂，其特征在于：所述ALDH2特异性扩增引物序列如下：上游引物F：5’‑TGGTGGCTACAAGATGTCG‑3’；下游引物R：5’‑GCAGACCCTCAAGCCCCAAC‑3’；荧光标记探针P：5’‑FAM‑T*G*C*AGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTG‑BHQ1‑3’；其中*标记碱基为硫代修饰。

【技术特征摘要】
1.一种基于自淬灭探针熔解曲线的人乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因多态性检测试剂盒，主要包括ALDH2特异性扩增引物和荧光标记探针，以及DNA提取试剂和PCR反应试剂，其特征在于：所述ALDH2特异性扩增引物序列如下：上游引物F：5’-TGGTGGCTACAAGATGTCG-3’；下游引物R：5’-GCAGACCCTCAAGCCCCAAC-3’；荧光标记探针P：5’-FAM-T*G*C*AGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTG-BHQ1-3’；其中*标记碱基为硫代修饰。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括强/弱杂合型阳性质粒和阴性对照品。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述强/弱杂合型阳性质粒由突变纯合型阳性质粒和野生纯合型阳性质粒等比例混合而成；突变纯合型阳性质粒序列如SEQIDNo.1所示，野生纯合型阳性质粒序列如SEQIDNo.2所示。4.利用权利要求1所述试剂盒检测人乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因多态性的方法，所述方法包括：(1)提取待测样品DNA；(2)配置P...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘小龙，刘景丰，许海坡，蔡志雄，曾永毅，董秀清，陈耕，
申请(专利权)人：福建医科大学孟超肝胆医院，
类型：发明
国别省市：福建,35