延长赖氨酸芽孢杆菌菌株、酶制剂及其降解农药残留的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种延长赖氨酸芽孢杆菌菌株、酶制剂及其降解农药残留的应用。本发明专利技术提供的延长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides)FY‑3菌株，其保藏编号为CGMCC No.13519。本发明专利技术还提供了菌株的筛选、诱导、驯化和农药农残降解活性酶的制备方法，即以毒死蜱为碳源进行目的菌筛选，将目的菌于单一农药和混合农药进行诱导驯化。将菌株进行发酵，收集菌体，破胞、离心，上清液可制备农残降解酶制剂，可降解蔬果中农药残留，在降解蔬果农残方面具有应用潜力。

【技术实现步骤摘要】
延长赖氨酸芽孢杆菌菌株、酶制剂及其降解农药残留的应用
本专利技术涉及生物技术降解农药残留领域，尤其涉及延长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusmacroides)菌株的筛选、诱导、驯化及在蔬果降解农药残留中的应用。
技术介绍
随着近年来农药的品种、产量及使用量剧增，在农业生产过程中混合施用多种农药的现象时有发生且较为严重，造成多种农药出现在同一产品中。食用农残超标的蔬菜水果会危害神经中枢、使神经传导功能紊乱；可诱发突变，导致畸形，影响后代健康；能诱发肝脏酶的改变，令肝脏肿大以致坏死；能侵犯肾脏而引起病变。残留农药在人体内蓄积，超过一定限度后会导致一些慢性疾病，如肌肉麻木、咳嗽等，甚至会诱发血管疾病、糖尿病和癌症等。生物修复技术是80年代以来出现和发展的清除和治理环境污染的生物工程技术，其主要利用生物特有的分解有毒有害物质的能力，去除污染环境如土壤中的污染物，达到清除环境污染的目的。微生物具有较强的适应和被驯化的能力，通过一定的适应过程，微生物产生相应的酶系，或通过基因突变等建立新的酶系来降解新的农药。提高食品安全具有重大的意义，但目前，尚未见到利用菌株或由其制成的酶制剂降解蔬果中的混合农药残留的报道。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供经筛选、农药诱导、驯化得到的一株延长赖氨酸芽孢杆菌菌株。本专利技术提供的延长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusmacroides)菌株(记为FY-3)，其保藏编号为CGMCCNo.13519。所述延长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusmacroides)菌株经筛选目的菌株、以及对目的菌株经单种农药及混合农药诱导、驯化获得，包括以下步骤：1)将筛选的目的菌株复壮；2)利用农药毒死蜱配制含不同有效成分浓度农药的培养基，将步骤1)复壮的目的菌株划线接种、培养并通过不断的诱导培育(通过不断提高农药含量)，培育出能耐受较高的毒死蜱浓度的目标菌株；3)将农药毒死蜱、多菌灵、吡虫啉和氯氟氰菊酯等浓度混合，并经稀释至一定浓度后添加进培养基内，配制成含不同有效成份浓度农药的培养基。再将步骤2)得到的目标菌株划线接种、培养并通过不断的诱导培育(通过不断提高农药含量)，培育得到耐受较高的农药浓度的菌株，最终分离得到一株延长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusmacroides)菌株(记为FY-3)。本专利技术的第二个目的是提供一种生产生物降解酶的方法。本专利技术提供的生产生物降解酶的方法，包括以下步骤：将上述延长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusmacroides)菌株FY-3发酵后，收集菌体、破胞、离心，提取上清液，得到生物降解酶溶液。上述生产生物降解酶的方法中，所述发酵的条件为在34-39℃、180-200rpm培养16-24小时。上述生产生物降解酶的方法中，所述发酵采用的发酵培养基的组分如下：每升所述发酵培养基包括胰蛋白胨17-19g、植物蛋白胨1-4g、氯化钠2-5g、磷酸氢二钾2-5g及葡萄糖2-5g，用水补足体积；发酵培养基的pH值为6.8-7.6，优选为7.0-7.4。上述生产生物降解酶的方法中，所述发酵具体包括以下步骤：将延长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusmacroides)菌株FY-3菌种经过扩大培养获得种子，将种子接种至所述发酵培养基中于所述发酵的条件下进行培养。所述扩大培养的条件为在34-39℃、180-200rpm培养16-24h。所述菌种为将上述延长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusmacroides)菌株FY-3的菌体悬浮在磷酸盐缓冲液中得到的溶液。上述生产生物降解酶的方法中，在所述发酵后，将发酵产物于12000-14000rpm、温度4-6℃，离心15-20min，收集菌体，将菌体重悬后高压破胞，然后于8000-10000rpm、温度4-6℃，离心50-65min，收集上清液，将上清液过滤，得到生物降解酶溶液。本专利技术的第三个目的是提供一种生物降解酶制剂。本专利技术提供的生物降解酶制剂，其活性成分为上述延长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusmacroides)菌株FY-3或上述生物降解酶。本专利技术的第四个目的是提供上述延长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusmacroides)菌株FY-3、生物降解酶及生物降解酶制剂在农残降解，特别是蔬果农药残留的降解中的应用。所述生物降解酶或生物降解酶制剂在蔬果农药残留降解中的使用浓度为2.5-5ppm，最优为3.5-4.5ppm，因具体蔬果而异。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术的实验证明，本专利技术诱导、驯化得到延长赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillusmacroides菌株FY-3，对其进行发酵培养后提取胞内酶可作为生物降解酶，该生物降解酶可作用于蔬果中的农药残留，使多种农药残留降解，达到去除农药残留的效果，在农药残留降解领域具有应用潜力。附图说明图1为基于延长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusmacroides)菌株FY-3的液态生物降解酶制剂处理圣女果的农药残留的结果。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步详细说明。实施例用于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中的转速，均为在半径为5.5cm的离心半径下的转速。实施例中采用比色法测定细菌数量，即浑浊度计数法；培养物的吸光值OD600表示细菌的生长量。实例1、延长赖氨酸芽孢杆菌菌株分离鉴定一、菌株的获得1、土壤样品的采集采集于农药厂排放口污泥。2、目的菌株的分离筛选称取污泥10g于100mL无机盐液体培养基中，无机盐液体培养基成分如下：MgSO4·7H2O0.2g；K2HPO40.1g；(NH4)2SO40.1g；CaSO40.04g；FeSO4·7H2O0.001g；去离子水1L；pH7.0。121℃灭菌30min。在无机盐液体培养基中添加浓度为100mg/L的毒死蜱，得培养液，于37℃、180r/min摇床培养，培养一周后，以10％的接种量接入新鲜培养液中，以后每周转接一次，如此反复多次驯化。最后，用平板稀释法进行分离纯化，接种到含有100ppm毒死蜱的LB培养基中，挑选生长最好的接种斜面，编号保存用于驯化。二、菌株的鉴定具体鉴定步骤如下：提取编号保存菌株的总DNA并作为模板，应用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATG-3′)，PCR扩增得到其ITS，经测序获得一条129bp的核苷酸序列(参见SEQ.ID.NO.1)，同源性比对分析表明：编号保存的菌株与已知菌种延长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusmacroides)的同源性最高。实例2、延长赖氨酸芽孢杆菌菌株诱导、驯化一、毒死蜱诱导、驯化1.毒死蜱配制的有效成分含量区间：300mg/L-800mg/L。制备含不同浓度毒死蜱的胰蛋白胨琼脂。将不同量的毒死蜱分别添加进胰蛋白胨琼脂内制成含有毒死蜱的培养基。具体步骤：1)毒死蜱配制成4500mg/L的农药标准液。分别取45本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种延长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides)菌株，其特征在于：该菌株的保藏编号为CGMCC No.13519。

【技术特征摘要】
1.一种延长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusmacroides)菌株，其特征在于：该菌株的保藏编号为CGMCCNo.13519。2.一种生物降解酶，其特征在于：该生物降解酶是利用延长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusmacroides)菌株进行发酵培养后提取菌体胞内酶而制成的，所述菌株的保藏编号为CGMCCNo.13519。3.一种生物降解酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将延长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusmacroides)菌株进行发酵后，收集菌体、破胞、离心，提取上清液，得到生物降解酶溶液，所述菌株的保藏编号为CGMCCNo.13519。4.根据权利要求3所述一种生物降解酶，其特征在于：所述发酵采用的培养基包括胰蛋白胨17-19g/L、植物蛋白胨1-4g/L、氯化钠2-5g/L、磷酸氢二钾2-5g/L及葡萄糖2-5g/L，培养基pH值为6.8-7.6。5.根据权利要求3所述一种生物降解酶，其特征在于：所述发...

【专利技术属性】
技术研发人员：常雪妮，基特·彦姆，薛建龙，迈克尔·里奥尼德斯·崎肯德思，谢知芳，纳泽·米尔，冯立雄，蒋丽娟，
申请(专利权)人：西安罗格斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西,61