人干扰素‑β变体缀合免疫细胞因子及其制备方法技术

本发明专利技术涉及具有人干扰素‑β变体缀合抗体或其片段的免疫细胞因子，和其制作方法。根据本发明专利技术，与天然干扰素‑β相比，人干扰素‑β变体具备更优越的活性或功能，并且此免疫细胞因子的生产率非常可观。此外，根据发明专利技术，此免疫细胞因子可以用作多发性硬化症或癌症的靶向治疗剂，因为该免疫细胞因子同时表现出了干扰素‑β的功能和绑定到特异性抗原的抗体的特征。

Human interferon beta variant conjugated cytokines and preparation method thereof

The present invention relates to immune cell factor with human interferon beta variant conjugated antibodies or fragments thereof, and its production method. According to the invention, compared with natural beta interferon, interferon beta variants have superior activity or function, and the immune cell factor productivity is very considerable. In addition, according to the invention, targeting therapeutic agents the immune cytokines can be used as multiple sclerosis or cancer, because the immune cytokines and showed interferon beta function and binding to characteristics of antibody specific antigen.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人干扰素-β变体缀合免疫细胞因子及其制备方法
本专利技术涉及一种含有人干扰素-β变体的免疫细胞因子及其制备方法，更具体地说，涉及一种包含干扰素-β变体缀合抗体的免疫细胞因子以及其制备方法，该干扰素-β变体具有优于天然干扰素-β的活性和功能。
技术介绍
本申请要求于2015年3月3日提交的韩国专利申请KR10-2015-0030037的优先权和权益，出于所有目的，该专利被引入本文作参考，即如在此充分阐述的一样。在药物中，基于调节免疫系统以达到预防以及/或治疗目的的概念，免疫疗法代表若干治疗策略。多年来，免疫疗法被用来治疗或预防各种病理状况。自细胞融合技术被开发生产单株抗体以来，研究人员已经生产了大量的单株抗体。此后，其他技术，包括用于生产人单株抗体的B细胞杂交瘤技术和EBV杂交瘤技术，已经被用来研制单株抗体的生产。单株抗体(mAb)可用来靶向几乎所有的抗原表位。它们对特定细胞/分子的特异性识别和缀合属性促进了mAbs作为对各种疾病状况的诊断和治疗试剂的发展。DNA重组技术已经被用于生产施用于人类的嵌合或人源化抗体。目前，数种单株抗体已经实现商用并被用来治疗癌症、传染性疾病、免疫疾病等，其中商用的例子包括利妥昔单抗、赫赛汀、阿瓦斯丁等。单株抗体是靶向分子，并且可位于特定区域(细胞、组织等)，例如病理组织。为了在特定病理组织站点靶向特定的分子，这一特征也带来了与各种物质(有效负载物)缀合的mAbs的发展。这些物质(有效负载物)可包括毒素、药物、放射性核素、药物前体等等。许多这样的缀合涉及活性部分(有效负载物)的化学缀合，以及抗体和冗余物(美国专利US4,671,958)的特定生产，这是一个易变的过程。在这些新分子中，免疫细胞因子有着特别的意义。免疫细胞因子是指含有抗体和细胞因子的融合蛋白，这种蛋白质同时保留抗原结合能力和细胞因子活性。细胞因子是一种信号蛋白和糖蛋白，就像激素和神经递质一样，广泛用于细胞通讯。虽然特定器官分泌激素到血液中、神经递质与神经活动相关，但就起源和用途而言，细胞因子是一种更多样化的化合物。它们是由各种造血细胞和非造血细胞类型产生，并可以对附近细胞或整个生物体产生影响，且有时高度依赖于其它化学物质的存在。细胞因子家族主要由具有原子质量为8-30kDa的较小的水溶性蛋白质和糖蛋白组成。细胞因子在自然和适应性免疫反应的功能化方面非常重要。细胞因子通常是由与病原体接触的免疫细胞分泌的，从而激活和招募更多的免疫细胞并增加对病原体的系统反应。在细胞因子中，干扰素(IFNs)是一种细胞因子且表现出抗病毒活性、抑制细胞增殖和调节天然免疫反应的功能。其中，干扰素-β(IFN-β)是一种具备五个α-螺旋的球形蛋白，其大小为22kD，当其聚糖被除去时为18kD(Arduinietal.,ProteinScience8:pp1867-1877,1999)。对于IFN-β临床应用的研究正在积极地进行着，特别是IFN-β作为改善、缓解或治疗多发性硬化症状的药物而受到关注(Goodkinetal.,Multiplesclerosis:Treatmentoptionsforpatientswithrelapsing-remittingandsecondaryprogressivemultiplesclerosis,1999)。据报道，除了多发性硬化症外，IFN-β还显示出多种免疫活性，如抗病毒活性、抑制细胞生长或抗生长活性、淋巴细胞毒性-上升活性、免疫调节活性、靶细胞分化诱导或抑制活性、巨噬细胞活化活性、细胞因子产生上升活性、细胞毒性T细胞效应上升活性和自然杀伤细胞上升活性，因此，IFN-β在治疗癌症、自身免疫疾病、病毒感染、HIV相关疾病，丙型肝炎，类风湿性关节炎等等是有效的(Pillingetal.,EuropeanJournalofImmunology29:pp1041-1050,1999；Youngetal.,Neurology51:pp682-689,1998；andCirellietal.,1995Majortherapeuticusesofinterferons.ClinImmunother3:pp27-87)。人干扰素-β也是一种糖蛋白，与此种蛋白相连接的聚糖部分在蛋白质的活性中起重要作用。因此，当将聚糖加入糖蛋白时，糖蛋白的活性可能上升。鉴于上述观点，韩国专利KR10-0781666公开了一种具有增强或改善活性或功能的人干扰素-β变体，其通过将聚糖引入作为糖蛋白的天然人干扰素-β中。因此，有必要去开发免疫细胞因子，在所述细胞因子中，为了在靶向治疗中使用表现效果优于天然干扰素-β药效的人干扰素-β变体，人干扰素-β需与抗体缀合。此外，还需要一种以高产率获得这种免疫细胞因子的制备方法。
技术实现思路
本专利技术技术问题的详细描述本专利技术者专利技术了一种免疫细胞因子，在该免疫细胞因子中，人干扰素-β变体缀合至抗体，所述人干扰素-β变体通过将聚糖引入天然人干扰素-β而使活性得以增强或改善，并发现，与天然干扰素-β缀合至抗体的免疫细胞因子相比，宿主细胞中的此种免疫细胞因子的表达水平显著增加，从而(令专利技术者)完成了本专利技术。因此，本专利技术的一个方面是提供一种免疫细胞因子，其包括：(a)人干扰素-β变体；和(b)直接或间接与人干扰素-β变体共价连接的抗体或其片段，其中人干扰素-β变体是选自下面(i)、(ii)和(iii)中的一种多肽，((i)包含在SEQIDNO：1中公开的所有氨基酸序列的多肽；(ii)包含SEQIDNO：1中公开的氨基酸序列的实质部分的多肽；以及(iii)基本上和(a)或(b)中多肽类似的多肽)，并且该多肽具有人干扰素-β活性，所述多肽包含N-连接糖链。本专利技术的另一方面是提供一种编码免疫细胞因子的多核苷酸。本专利技术的另一方面是提供一种提高靶特异性人干扰素-β产率的方法，该方法包括：(a)将多核苷酸克隆到表达载体中，所述多核苷酸编码一种包括人干扰素-β变体，(b)肽接头，以及(c)抗体或其片段的融合多肽；(b)将表达载体克隆到宿主细胞中；(c)培养宿主细胞；以及(d)从细胞或培养基中收集融合多肽，其中所述人干扰素-β变体包含选自SEQIDNO：2至SEQIDNO：4的肽序列。本专利技术的另一方面是提供一种包含多核苷酸的载体。本专利技术的另一方面是提供一种载体转染的宿主细胞。本专利技术的另一方面还提供一种制备免疫细胞因子的方法，该方法包括：(a)提供宿主细胞；(b)培养提供的细胞；以及(c)通过从细胞或培养基中收集免疫细胞因子来制备此种免疫细胞因子。技术方案根据本专利技术的一个方面，提供一种免疫细胞因子，其包括：(a)人干扰素-β变体；以及(b)直接或间接与人干扰素-β变体共价连接的抗体或其片段，其中人干扰素-β变体是选自下面(i)、(ii)和(iii)中的一种多肽，(i)包含SEQIDNO：1中公开的所有氨基酸序列的多肽；(ii)包含SEQIDNO：1中公开的氨基酸序列的实质部分的多肽；以及(iii)包含基本上与(a)或(b)中的多肽相似的多肽，并且该多肽具有人干扰素-β活性，所述多肽包含N-连接糖链。根据本专利技术的另一方面，还提供一种提高靶特异性人干扰素-β产率的方法，该方法包括：(a)将多核苷酸克隆到表达载体中，所述多核本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫细胞因子，包括：(a)人干扰素‑β变体；和(b)与人干扰素‑β变体直接或间接共价连接的抗体或其片段；其中，所述人干扰素‑β变体是一种多肽，其选自下面(i)、(ii)、(iii)中的一种，该多肽具有人干扰素‑β活性，所述多肽包括N‑连接糖链：(i)、由SEQ ID NO：1中公开的所有氨基酸序列组成的多肽；(ii)由SEQ ID NO：1中公开的氨基酸序列的实质部分组成的多肽；和(iii)基本上与(a)或(b)中的多肽相似的多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.03 KR 10-2015-00300371.一种免疫细胞因子，包括：(a)人干扰素-β变体；和(b)与人干扰素-β变体直接或间接共价连接的抗体或其片段；其中，所述人干扰素-β变体是一种多肽，其选自下面(i)、(ii)、(iii)中的一种，该多肽具有人干扰素-β活性，所述多肽包括N-连接糖链：(i)、由SEQIDNO：1中公开的所有氨基酸序列组成的多肽；(ii)由SEQIDNO：1中公开的氨基酸序列的实质部分组成的多肽；和(iii)基本上与(a)或(b)中的多肽相似的多肽。2.根据权利要求1所述的免疫细胞因子，其特征在于，所述抗体或其片段是肿瘤抗原的抗体或其片段。3.根据权利要求1所述的免疫细胞因子，其特征在于，所述人干扰素-β变体通过肽接头缀合抗体或其片段。4.根据权利要求3所述的免疫细胞因子，其特征在于，所述接头包括选自SEQIDNO：5至SEQIDNO：11的氨基酸序列。5.根据权利要求1至4中的任一项所述的免疫细胞因子，其特征在于，所述人干扰素-β变体多肽的氨基酸序列位于重链C端，轻链C端，或抗体或其片段的氨基酸序列的重链和轻链的C端的任何一端。6.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：慎英基，金永德，崔俊英，金台殷，李镕辰，李柱镐，金暎彣，
申请(专利权)人：瑷备恩株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国,KR