一种利用纳米通道技术检测癌症的方法技术

本发明专利技术的提供一种利用纳米通道技术检测癌症的方法，通过检测癌症相关的microRNA标志物，实现癌症的早期检测，以填补该项目研究领域的空白。经验证，采用本方法可以简单、快速的检测出肿瘤生物标志物microRNA，并可根据其阻塞时间、电流幅度等判断出microRNA的种类。

A method of detecting cancer by using nanoscale technology

The invention provides a method for detecting cancer by using nanochannel technology, and detects cancer related microRNA markers to achieve early detection of cancer, so as to fill gaps in the research area of the project. It is proved that this method can detect tumor biomarker microRNA easily and quickly, and can identify the type of microRNA according to its blocking time and current amplitude.

【技术实现步骤摘要】
一种利用纳米通道技术检测癌症的方法
本专利技术属于纳米通道基因测序
，具体涉及一种利用纳米通道技术检测癌症的方法。
技术介绍
纳米通道检测技术是将α溶血素插入脂质双分子层中形成天然的纳米通道，纳米通道与两个流体池相连，对纳米通道两端电极施加电压时，可以产生一个恒定的基准离子电流。当核酸序列通过时，由于物理占位，将会改变纳米通道的电阻，电阻的变化将导致离子电流的变化，形成类似方波信号的调制电流。调制电流的波形与生物分子的物理信息直接相关，分析方波信号的幅度、持续时间，就能辨识核酸序列长度和类别，这可视为一种天然探测单分子的传感器（见图1）。microRNA发挥着致癌或者抑癌的作用，通过转录后调节机制，参与机体生理和病理过程，与肿瘤的发生、发展、转移及预后相关，可作为癌症的生物标志及治疗预后指标。利用纳米通道检测技术检测microRNA被认为是检测癌症领域的新发展方向之一，一旦获得实质性突破将会给医学检测带来一场技术性革新。本专利技术基于纳米通道检测技术，为快速、准确、低成本实现癌症早期诊断提供新的方法，以填补该项目研究领域的空白。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用纳米通道技术检测癌症的方法，通过检测癌症相关的microRNA标志物，实现癌症的早期检测。本专利技术提供详细的实验步骤以及最佳发应条件，以填补该项目研究领域的空白。本专利技术所采取的技术方案如下。一种利用纳米通道技术检测癌症的方法，该方法需要用到一种样品池，样品池分为cis和trans两个隔室（B，B'），隔室之间由120-159μm的Toflon薄膜隔离开。孔A与孔A'是用来第一次加液体和插入电极的，通过电极与膜片钳相连，将化学信号转化为电信号，之后液体的加入从下面孔C和孔C'操作。该方法包括以下步骤：（1）在腔室B和腔室B'中分别放入磁子，然后分别从孔A和孔A'中注入超纯水，以液面高于微米孔为准，计算出所需超纯水的体积2mL；（2）取出磁子，倒出超纯水，并反复冲洗Toflon薄膜、腔室及孔洞，最后用无水乙醇冲洗；（3）冲洗干净后，用氮气将腔室内以及Toflon薄膜上残留的液滴吹干；（4）然后，在Toflon薄膜两边靠近微米孔处分别滴上一滴约10~15μLH液，并迅速吹开，使其在膜上延展散开。其中，H液为1mL戊烷与100μL十六烷的混合液；（5）在腔室B和腔室B'中分别放入磁子，然后，从孔A和孔A'分别用移液器加入0.8~1.1mL含10mmol/LTris和1mol/LKCl缓冲液，再分别插入Ag/AgCl电极；（6）然后，孔A的电极与探头的trans端相连，孔A'的电极与探头的cis端相连；（7）用25μL的微量移液器分别在腔室B和腔室B'中加入15~25μLL液，使L液在液面上均匀地铺开，然后等待30s-1min。其中，L液为25mg磷脂与2.5mL戊烷的混合液迅速轻吹；（8）从孔C和孔C'的中分别再加入0.8~1.1mL的10mmol/LTris缓冲液，观察是否形成磷脂双分子层，如形成，则进行后续实验；如未形成，则从孔C和孔C'端反复吹打几次，直至其形成磷脂双层；（9）在形成磷脂双分子层后，对系统施加电压+180mV~+200mV，在孔B'中加入α-溶血素溶液其终浓度为0.0125~0.145ng/mL，并开启孔B'的搅拌系统，控制合适的转速，搅拌约2min，形成纳米单通道；（10）形成纳米通道后，在孔B'中加入一定量的microRNA，开启搅拌系统，搅拌约5s后，开始收集检测信号。经验证，采用本方法可以简单、快速的检测出肿瘤生物标志物microRNA，并可根据其阻塞时间、电流幅度等判断出microRNA的种类。附图说明图1纳米通道技术原理示意图。图2样品池结构示意图。图3纳米通道检测Mir-31：(左)典型的单通道信号记录(右)对应的散点图。图4不同的核酸样品与平均阻滞时间图。图5纳米通道检测Mir-31：(左)典型的单通道信号记录(右)对应的散点图。图6不同浓度Mir-31的电流振幅直方图与浓度曲线图。具体实施方式下面以乳腺癌为例对本专利技术做进一步的解释说明。介绍具体实施例前，对本专利技术所用到的主要仪器设备和试剂介绍如下。主要设备：单探头超低噪声膜片钳放大器：Axopatch200B，美国MD公司（Axon）；AxonDigidata1550B数据采集系统：1550B0/B1/B4，美国MD公司（Axon）；防震台：TS/TM，上海亿奥信息光学科技有限公司；高速离心机：JW-3021H，安徽嘉文仪器装备有限公司；电子天平：BSA124S-CW，北京赛多利斯科学仪器有限公司；超纯水机：smart-N30uV，上海康雷分析仪器有限公司；pH计：UB-7，北京赛多利斯科学仪器有限公司。主要试剂：卵磷脂：西格玛奥德里奇贸易有限公司批号850356-03-145；正戊烷：西格玛奥德里奇贸易有限公司批号SZBD300BV；十六烷：西格玛奥德里奇贸易有限公司批号SHBD8135V；Tris：北京索莱宝科技有限公司批号1120I0712；α溶血素：西格玛奥德里奇贸易有限公司批号124M4065V；氯化钾：天津市科密欧化学试剂有限公司批号20160305。1、乳腺癌生物标记物的查找与确定查找乳腺癌相关的MicroRNA标志物有miR-31，miR-21，miR-200c，miR-145，miR-21，miR-147，miR-10b，miR-34a，miR-195，let-7a，miR-205，miR-373，miR-520。本实验选取MicroRNA标志物miR-31进行检测。2、基于纳米单通道对乳腺癌生物标记物的检测实验需要使用样品池，如图2示，样品池分为cis和trans两个隔室（B，B'），隔室之间由120-159μm的Toflon薄膜隔离开。孔A与孔A'是用来第一次加液体和插入电极的，之后液体的加入从下面三个小孔C和孔C'操作。实验步骤如下：（1）在腔室B和腔室B'中分别放入磁子，然后分别从孔A和孔A'中注入超纯水，以液面高于微米孔为准，计算出所需超纯水的体积2mL；（2）取出磁子，倒出超纯水，并反复冲洗Toflon薄膜、腔室及孔洞，最后用无水乙醇冲洗；（3）冲洗干净后，用氮气将腔室内以及Toflon薄膜上残留的液滴吹干；（4）然后，在Toflon薄膜两边靠近微米孔处分别滴上一滴约10μLH液，并迅速吹开，使其在膜上延展散开；（5）在腔室B和腔室B'中分别放入磁子，然后，从孔A和孔A'分别用移液器加入1mL含10mmol/LTris，1mol/LKCl缓冲液，再分别插入Ag/AgCl电极；（6）然后，孔A的电极与探头的trans端相连，孔A'的电极与探头的cis端相连；（7）用25μL的微量移液器分别在腔室B和腔室B'中滴加1-2滴约15μLL液，迅速轻吹，使L液在液面上均匀地铺开，然后等待30s-1min；（8）随后，从孔C和孔C'中分别再加入1mL缓冲液，观察是否形成磷脂双分子层，如形成，则进行后续实验；如未形成，则从孔C和孔C'端反复吹打几次，直至其形成磷脂双层；（9）在形成磷脂双分子层后，对系统施加电压+180mV，在孔B'中加入α-溶血素溶液其终浓度为0.0125ng/mL，并开启孔B'的搅拌系统，控制合适的转速，搅拌约2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用纳米通道技术检测癌症的方法，该方法需要用到一种样品池，样品池分为cis和trans两个隔室（B，B'），隔室之间由120 ‑159μm的 Toflon薄膜隔离开，孔A与孔A'是用来第一次加液体和插入电极的，通过电极与膜片钳相连，将化学信号转化为电信号，之后液体的加入从下面三个小孔孔C和孔C'操作，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）在腔室B和腔室B'中分别放入磁子，然后分别从孔A和孔A'中注入超纯水；（2）取出磁子，倒出超纯水，并反复冲洗Toflon薄膜、腔室及孔洞，最后用无水乙醇冲洗；（3）冲洗干净后，用氮气将腔室内以及Toflon薄膜上残留的液滴吹干；（4）在Toflon薄膜两边靠近微米孔处分别加入H液，并迅速吹开，使其在膜上延展散开；（5）在腔室B和腔室B'中分别放入磁子，然后，从孔A和孔A'分别用移液器加入缓冲液，再分别插入Ag/AgCl电极；（6）孔A的电极与探头的trans端相连，孔A'的电极与探头的cis端相连；（7）分别在腔室B和腔室B'中加入L液，迅速轻吹，使L液在液面上均匀地铺开，然后等待30s‑1min；（8）从孔C和孔C'分别再加入缓冲液，观察是否形成磷脂双分子层，如形成，则进行后续实验；如未形成，则从孔C和孔C' 端反复吹打几次，直至其形成磷脂双分子层；（9）在形成磷脂双分子层后，对系统施加电压，在孔B'中加入α‑溶血素溶液，并开启孔B'的搅拌系统，控制合适的转速，搅拌约2min，形成纳米通道；（10）形成纳米通道后，在孔B'中加入一定量的microRNA，开启搅拌系统，搅拌约5s后，开始收集检测信号。...

【技术特征摘要】
1.一种利用纳米通道技术检测癌症的方法，该方法需要用到一种样品池，样品池分为cis和trans两个隔室（B，B'），隔室之间由120-159μm的Toflon薄膜隔离开，孔A与孔A'是用来第一次加液体和插入电极的，通过电极与膜片钳相连，将化学信号转化为电信号，之后液体的加入从下面三个小孔孔C和孔C'操作，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）在腔室B和腔室B'中分别放入磁子，然后分别从孔A和孔A'中注入超纯水；（2）取出磁子，倒出超纯水，并反复冲洗Toflon薄膜、腔室及孔洞，最后用无水乙醇冲洗；（3）冲洗干净后，用氮气将腔室内以及Toflon薄膜上残留的液滴吹干；（4）在Toflon薄膜两边靠近微米孔处分别加入H液，并迅速吹开，使其在膜上延展散开；（5）在腔室B和腔室B'中分别放入磁子，然后，从孔A和孔A'分别用移液器加入缓冲液，再分别插入Ag/AgCl电极；（6）孔A的电极与探头的trans端相连，孔A'的电极与探头的cis端相连；（7）分别在腔室B和腔室B'中加入L液，迅速轻吹，使L液在液面上均匀地铺开，然后等待30s-1min；（8）从孔C和孔C'分别再加入缓冲液，观察是否形成磷脂双分子层，如形成，则进行后续实验；如未形成，则从孔C和孔C'端反复吹打几次，直至其形成磷脂双分子层；（9）在形成磷脂双分子层后，对系统施加电压，在孔B'中加入α...

【专利技术属性】
技术研发人员：李贝贝，李梦臻，张芃芃，管希云，李华中，
申请(专利权)人：河南金泰生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41