高效乙醇发酵菌制造技术

本发明专利技术的课题在于提供在不导入外来基因的情况下得到乙醇产生效率高的发酵菌。本发明专利技术进一步的课题在于得到对于妨碍发酵菌增殖的有机酸等增殖障碍物质具有耐性的发酵菌。向通过育种能够由五碳糖和六碳糖有效地生产乙醇的季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)中通过自克隆导入转醛醇酶、醇脱氢酶基因，由此制成提高了乙醇生产性能的菌。本菌株以保藏号NITE BP‑01976被保藏于专利微生物保藏中心。

High efficiency ethanol fermentative bacteria

The invention of the present invention is to provide fermenting bacteria with high efficiency of ethanol production without introducing foreign genes. A further subject of the invention is to obtain fermenting bacteria with resistance to the organic acids such as organic acids, such as organic acids, which impede the proliferation of fermented bacteria. From five to six carbon sugar and sugar effectively produce ethanol through the breeding of pichiaguilliermondii (Meyerozyma guilliermondii) by cloning into transaldolase, alcohol dehydrogenase gene, thus improving the production performance of ethanol made from bacteria. The strain under the accession number NITE BP 01976 is preserved in the patent microbial preservation center.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】高效乙醇发酵菌
本专利技术涉及在使用木质纤维素类生物质生成生物乙醇的过程中用于发酵糖化溶液的微生物。特别涉及在使用木质纤维素类生物质生成生物乙醇的过程中能够由五碳糖(下文中也称为C5)以及六碳糖(下文中也称为C6)有效地生成乙醇的微生物。
技术介绍
生物乙醇作为由生物质生成的不会发生枯竭的可再生资源而倍受期待。另外，由于燃烧生物乙醇而生成的二氧化碳为碳中性的，因而据信通过促进生物乙醇的利用可抑制作为地球温室化的主要原因的二氧化碳的增加。生物乙醇是将生物质发酵并进行蒸馏提纯乙醇制得的。为了提高生物乙醇的收率，需要由糖化溶液中生成大多数的醇。在生物乙醇生成的过程中通常使用的酵母无法将木糖、阿拉伯糖等五碳糖转换为醇，因而作为发酵原料，仅使用了六碳糖。尽管根据原料而不同，但在代表性的生物质中被认为含有35～45％的纤维素、25～40％的半纤维素、15～30％的木质素。因而，在不仅可利用六碳糖聚合而成的纤维素作为底物、而且还可利用主要含有作为五碳糖的木糖等的半纤维素作为底物时，可有效地产生乙醇。木糖被认为是在生物质中大量含有的糖，其含量仅次于葡萄糖，有效地利用五碳糖是生物乙醇产生中的一大课题。目前为止公开了少量利用木糖的技术，其是通过经基因重组而赋予木糖利用能力、或者利用木糖产生乙醇的微生物的利用等而实现的。在专利文献1中公开了下述专利技术：将具有木糖转运体活性的基因导入到宿主细胞中，从而将木糖(C5)转换为木酮糖，整合在糖酵解系统的戊糖磷酸途径中，在发酵中加以利用。在专利文献2中公开了利用被赋予了阿拉伯糖转运体的酵母来生成醇的技术。与专利文献1同样地、将阿拉伯糖(C5糖)经阿拉伯糖醇、木酮糖而整合在糖酵解系统的戊糖磷酸途径中，在发酵中加以利用。在非专利文献1中公开了通过将源自大肠杆菌的木糖同化基因重组到发酵单胞菌中而赋予木糖同化能力的内容。在非专利文献2中记载了毕赤属酵母可利用木糖生产乙醇的内容。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2012-170422号公报专利文献2：美国专利申请公开第2013/189788号说明书非专利文献非专利文献1：Zhang,M.,etal.,Science,1995.Vol.267,pp.240-243.非专利文献2：Bicho,P.A.,etal.,Appl.Environ.Microbiol.,1988,Vol.54,pp.50-54.
技术实现思路
专利技术所要解决的问题但是，专利文献1的专利技术是将源自季也蒙假丝酵母(Candidaguilliermondii)的具有木糖转运体活性的蛋白质导入到作为宿主的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中。即导入了外来基因。另外，专利文献2的专利技术，尽管转运基因不同，但也是向宿主中导入不同种基因的专利技术。另外，非专利文献1所记载的技术是导入木糖同化基因的技术，与上述专利文献1和2的技术思想不同，但导入外来基因这一点不变。因此，上述专利文献1和2、非专利文献1均需要采取用于实施联合国所采纳的“关于生物多样性公约的卡塔赫纳生物安全议定书”的封锁对策。从而需要用于保证生物安全的设施，因而利用该细菌生成乙醇从成本方面考虑是不利的。另外，根据非专利文献2记载的技术，关于毕赤属酵母的利用，由于野生型的毕赤属酵母的木糖利用性低，因而乙醇产生效率并不那么高。本专利技术的课题在于在不导入外来基因的情况下得到乙醇产生效率高的发酵菌。用于解决课题的手段本专利技术涉及一种由五碳糖和六碳糖有效地生成乙醇的发酵菌，其特征在于，向以保藏号NITEBP-01964被保藏于专利微生物保藏中心的发酵菌中通过自克隆导入了转醛醇酶、醇脱氢酶基因。野生型季也蒙毕赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)具备木糖同化能力。但是并不是说其具备对于生产生物乙醇为充分的木糖利用能力。于2014年11月19日(保藏日)以保藏号NITEBP-01964被保藏于专利微生物保藏中心(日本国〒292-0818独立行政法人日本国家技术与评价研究所专利微生物保藏中心千叶县木更津市上总镰足2-5-8122号室)的菌(下文也称为BP-01964菌株)是通过对季也蒙毕赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)进行菌株育种，选择出五炭糖的利用效率高的菌而得到的菌。其结果，选择出了相对于亲代菌株具备约2倍乙醇生成性能的菌。本专利技术的菌株是向BP-01964的菌中通过自克隆进一步导入转醛醇酶、醇脱氢酶基因从而提高乙醇产生能力的菌株。导入季也蒙毕赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)自身的酶基因时，不需要依据卡塔赫纳法的封锁对策。因而，其不需要用于生物安全的特殊设施，能够使用现有的设备。进一步地，本专利技术的菌的特征在于，其是上述基因导入菌株中尤其是乙醇产生能力高的、于2014年12月4日(保藏日)以保藏号NITEBP-01976被保藏于专利微生物保藏中心的菌(下文也称为BP-01976菌株)。在向BP-01964菌株中通过自克隆导入了转醛醇酶、醇脱氢酶基因的重组菌株中，也特别是以保藏号BP-01976被保藏的菌株的乙醇生成能力高。附图说明图1是示出在通过基因重组导入的菌株中，转醛醇酶的表达增强、发酵收率提高的图。图2是示出亲代菌株(N菌株)、通过育种提高了乙醇产生的BP-01964菌株、以及本专利技术的BP-01976菌株的发酵收率的图。图3是示出浆液发酵中的葡萄糖、木糖同化能力的图。图4是示出浆液发酵、澄清液发酵中的发酵收率的图。具体实施方式以下，对本专利技术的菌株进行说明。实施例1.菌株的分离使用源自稻秆的糖液对季也蒙毕赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)的亲代菌株(N菌株)进行育种，选择出乙醇生成能力高的菌株。将日本熊谷产的稻秆浸入等量的25质量％氨水中，于80℃浸入3小时后，将氨解吸出。将处理后的生物质用10％NaOH将pH调节至4后，添加支顶孢属纤维素酶(MeijiSeikapharma公司制)，于50℃进行72小时酶糖化。将所制作的浆液通过压滤法进行固液分离回收液体。使用该液体(下文也称为澄清液)，添加诱变剂进行19个月的驯化培养，分选出发酵性能提高的菌株。发酵性能提高的菌株的分选以规定时间后的生成乙醇量为基准来进行。于2014年11月19日(保藏日)将发酵性能高的菌株以保藏号NITEBP-01964保藏于独立行政法人日本国家技术与评价研究所专利微生物保藏中心。虽然在此未示出，BP-01964菌株是相对于野生型(N菌株)产生2倍以上乙醇的菌株，进一步确认到不仅作为C6的葡萄糖的同化能力提高，而且作为C5的木糖的同化能力的也得到提高。接着，向BP-01964菌株中通过自克隆导入转醛醇酶、醇脱氢酶基因，进一步得到乙醇生成能力高的菌。使用氨处理的稻秆液，通过糖化酶处理而得到糖液时，产生了副产物即有机酸、醛、酚等发酵阻碍物质。特别是乙酸以约1000mg/L的浓度极大量存在，使发酵收率降低。因此，只要能够抑制由乙酸引起的对发酵菌的增殖阻碍，就能够进一步地提高乙醇的产生效率。转醛醇酶是对由糖酵解系统分支出的戊糖磷酸途径中由景天庚酮糖-7-磷酸(S7P)和甘油醛3磷酸(GAP)代谢为赤藓糖-4-磷酸(E4P)和果糖6磷酸(F6P)进行催化的酶。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效乙醇发酵菌，其是由五碳糖和六碳糖有效地产生乙醇的发酵菌，该发酵菌的特征在于，其是向以保藏号NITE BP‑01964被保藏于专利微生物保藏中心的发酵菌中通过自克隆导入了转醛醇酶、醇脱氢酶基因而得到的菌。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种高效乙醇发酵菌，其是由五碳糖和六碳糖有效地产生乙醇的发酵菌，该发酵菌的特征在于，其是向以保藏号NITEBP-01964被保藏于专利微生物保藏中心的发酵菌中...

【专利技术属性】
技术研发人员：土田芳树，栗原育美，今井友裕，小池郁，
申请(专利权)人：本田技研工业株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP