一种基于渗滤法的HIV-1/2型确认与初筛二合一试剂及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种生物检测试剂及其使用方法，特别涉及一种基于渗滤法的HIV‑1/2型确认与初筛二合一试剂及其制备方法。本发明专利技术所述的制备方法，包括以下步骤：在硝酸纤维素膜上包被HIV‑1型抗原和HIV‑2型抗原。

A filtration method HIV 1/2 verification based on screening and combination of reagent and preparation method thereof

The invention relates to a biological detection reagent and use method thereof, particularly relates to a method of HIV infiltration type 1/2 screening and confirmation based on combined reagent and preparation method thereof. The preparation process of the present invention, which comprises the following steps: the nitrocellulose membrane was coated on the HIV type 1 antigen and HIV antigen type 2.

【技术实现步骤摘要】
一种基于渗滤法的HIV-1/2型确认与初筛二合一试剂及其制备方法
本专利技术涉及一种生物检测试剂及其使用方法，特别涉及一种基于渗滤法的HIV-1/2型确认与初筛二合一试剂及其制备方法。
技术介绍
现有的HIV确证方法主要为WB、RIBA和利用不同公司的产品进行两次酶免检测等，这些技术实现HIV的确证速度较慢，操作繁琐不能满足被检测者立即查看确证结果，且检测的样本只能使用血清或血浆；国内推荐的HIV确证方法WB、RIBA等只能用于HIV的确证，而不能用于对高危人群的筛查检测。本专利技术在现有技术的基础上开发了一种快速检测试剂，可在30min以内完成对初筛为HIV阳性的样本进行确认，且适用于检测全血、血清及血浆样本。本专利技术试剂通过对样本的重复检测或稀释，确认结果可区分患者感染为HIV-1型、HIV-2型感染还是HIV-1及HIV-2混合感染，现行的检测试剂只能实现对HIV-1的确证，并提示是否感染HIV-2。本专利技术试剂比RIBA、WB等具有更高的检测灵敏性，缩短了HIV检测的“窗口期”，提高HIV检出效果。
技术实现思路
本专利技术提供一种基于渗滤法的HIV-1/2型确认与初筛二合一试剂的制备方法，所述制备方法，包括以下步骤：在硝酸纤维素膜上包被HIV-1型抗原和HIV-2型抗原。其中，所述包被的HIV-1型抗原和HIV-2型抗原为不同浓度，其中能够识别HIV-1及HIV-2抗体检测点的抗原包被浓度高于分别特异性识别HIV-1抗体和HIV-2抗体检测点的抗原包被浓度。优选的，本专利技术的方法如下：在硝酸纤维膜上包被四个点，用于包被的抗原分别用探针包被液稀释至包被浓度，每个点按0.5ul进行点样，其中质控点①包被抗人IgG，其包被浓度为0.1mg/ml～5mg/ml；检测点③混合包被HIV-1型抗原gp41和HIV-2型抗原gp36，其包被浓度均为0.1mg/ml～5mg/ml；检测点②包被HIV-1型抗原gp41+gp120，其包被浓度为0.01mg/ml～1mg/ml，其浓度要低于检测点③中gp41的浓度，以保证其特异性识别HIV-1抗体，降低假阳性的产生；检测点④包被HIV-2型抗原gp36，其包被浓度为0.01mg/ml～1mg/ml，其浓度要低于检测点③中gp36的浓度。以保证其特异性识别HIV-1抗体，以降低假阳性的产生；其中检测点③的抗原浓度为检测点②抗原浓度的2-8倍，检测点③的抗原浓度为检测点④抗原浓度的2-5倍。包被完成后放置于37℃条件干燥。检测结果的显示，可以是三种形式，也可以是其它不同点和线的组合形式见附图1。本专利技术进一步提供使用上述方法制备的一种基于渗滤法的HIV-1/2型确认与初筛二合一试剂及其使用方法。当所述试剂用作确认试剂时，使用方法如下：首先加入待测样本(血清、血浆直接加样，全血经过本专利提供的渗滤装置过滤后加样)，待样本渗入硝酸纤维膜后滴加标记有抗人IgG、proteinA或proteinG的胶体金探针进行显色并进行结果判读；第一步判读：如果仅①②③同时显色，则可以确认为HIV阳性，且为HIV-1型阳性；如果仅①③④同时显色，则可以确认为HIV阳性并提示其为HIV-2型阳性；如果①②③④均显色，则可以确认为HIV阳性，且为HIV-1型阳性，并提示可能为HIV-1/2同时阳性。其他所有情况均为不确定。第二步判读：对于不确定的判读结果，如果是仅①②显色的情况，则同时做将样本量加倍和将样本稀释一倍后进行检测两个实验，其中任何一个实验出现仅①②③显色或仅①②④显色或①②③④均显色情况，则返回第一步进行结果判读。当所述试剂用作初筛试剂时，使用方法如下：首先加入待测样本(血清、血浆直接加样，全血经过本专利提供的渗滤装置过滤后加样)，待样本渗入硝酸纤维膜后滴加标记有抗人IgG、proteinA或proteinG的胶体金探针进行显色并进行结果判读。若仅①显色，则样本为HIV阴性；若①②同时显色，则判读为HIV阳性，③④是否显色不影响最终阴阳性的判读，仅在结果判读为阳性的基础上，提示其可能为HIV-1型阳性或HIV-2型阳性或HIV-1/2同时阳性。本专利技术基于斑点金免疫渗滤原理，通过设置滤血装置、免疫渗滤检测装置、固化的金标二抗、样品稀释液、洗涤液等组成检测体系。为此，本专利技术进一步提供检测体系，包括塑料模具、吸水材料、硝酸纤维素膜(NC膜)组成的免疫渗滤装置，在NC膜上包被抗人IgG的质控点(线)和HIV的三种抗原的点(线)，其中一组为HIV1+2混合包被的抗原，另两组分别为HIV-1和HIV-2特异性的抗原。通过本专利技术的检测体系，可以满足HIV确证的三次检测，保证其特异性识别HIV-1抗体，以降低假阳性的产生。本专利技术进一步包括待测样本的处理：其方法是，对于待检测的样本，若是全血样本，需将血液用样本稀释液按1:1稀释后，加入滤血装置中，将过滤的1滴(约40ul)液体直接滴加至NC膜上；若为血清、血浆样品则直接取1滴(约40ul)滴加至NC膜上，液体渗滤完后用抗人IgG的胶体金进行显色。结果的判读：本试剂用于HIV初筛阳性的样本进行确证检测时，若仅显示①点，则被检测样本为阴性；同时显示①②③三点则判定检测者为HIV-1阳性；显示①②④三点时则判定为HIV-2感染；当①②③④均显色时，判定为HIV-1感染，提示可能同时感染HIV-2；若检测结果为①③则为不确定，将通过加样两次和稀释2倍分别检测，进一步确定样品是否为阳性，若双检测分别为①③点显色和①②③三点显色则判定为阳性，否则判定为待确证；其他显色结果为无效检测。最终给出被检测样本为阴性、阳性或不确定性的结果。紧急情况下本产品用于HIV初筛检测时，只要满足①②检测点显色即将样本判定为HIV抗体阳性，并选择其它试剂对样本进行确证检测，确定样本是否为HIV阳性；当只有质控点①显色时，可直接将该样本判定为HIV阴性。本专利技术极大地缩短了HIV的确证时间，通过将待确证样本，利用稀释重复检测可以区分感染HIV-1或HIV-2感染，从而达到同时分型的目的。可以利用全血样品进行HIV确证，无需制备血清或血浆；本试剂具有更高的检测灵敏性，缩短了HIV检测的“窗口期”，提高HIV检出效果。以下为本专利技术技术方案和现有技术方案实施效果比较表：附图说明图1包被形式包括但不限于图1的几种形式：图2对血清、血浆型样本进行HIV抗体检测，抗原在NC膜上分布图图3对血清、血浆型样本进行HIV抗体检测，结果的判读图4对血清、血浆型样本进行HIV抗体检测，检测结果举例图5对全血型样本进行HIV抗体检测，抗原在NC膜上分布图图6对全血型样本进行HIV抗体检测，结果的判读图7对全血型样本进行HIV抗体检测，检测结果举例具体实施方式以下通过实施例进一步说明本专利技术，但不作为对本专利技术的限制。实施例1应用本专利技术对血清、血浆型样本进行HIV抗体检测：一.配套试剂：探针包被液：980μL的1XPBS溶液中加入20μL异丙醇，震荡混匀，分装保存于4℃备用。洗涤液PBST：50μL吐温于-20溶于10ml1XPBS的溶液中，震荡混匀，室温保存。胶体金标记抗体稀释液：称取100mgBSA溶于10ml的1XPBS溶液中，震荡混匀。胶体金固化片：将液态的胶体金浸泡多层滤纸，进行冷冻固化，并裁剪成小片，后续用于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于渗滤法的HIV‑1/2型确认与初筛二合一试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在硝酸纤维素膜上包被HIV‑1型抗原和HIV‑2型抗原。

【技术特征摘要】
1.一种基于渗滤法的HIV-1/2型确认与初筛二合一试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在硝酸纤维素膜上包被HIV-1型抗原和HIV-2型抗原。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测点上包被的HIV-1型抗原和HIV-2型抗原为不同浓度，其中能够同时识别HIV-1及HIV-2抗体检测点的抗原包被浓度高于分别特异性识别HIV-1抗体和HIV-2抗体检测点的抗原包被浓度。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在硝酸纤维素膜上包被四个点，用于包被的抗原分别用探针包被液稀释至包被浓度，每个点按0.5ul进行点样，其中质控点①包被抗人IgG，其包被浓度为0.1mg/ml～5mg/ml；检测点③混合包被HIV-1型抗原gp41和HIV-2型抗原gp36，其包被浓度均为0.1mg/ml～5mg/ml；检测点②包被HIV-1型抗原gp41+gp120，其包被浓度为0.01mg/ml～1mg/ml，其浓度要低于检测点③中gp41的浓度，检测点④包被HIV-2型抗原gp36，其包被浓度为0.01mg/ml～1mg/ml，其浓度要低于检测点③中gp36的浓度。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中检测点③的抗原浓度为检测点②抗原浓度的2-8倍，检测点③的抗原浓度为检测点④抗原浓度的2-5倍。5.一种基于渗滤法的HIV-1/2型确认与初筛二合一试剂，其特征在于，所述试剂根据权利要求3的方法制备。6.权利要求5所述试剂的使用方法，其特征在于，当所述试剂用作确认试剂时，方法如下：首先加入待测样本(血清、血浆直接加样，全血经过本专利提供的渗滤装置过滤后加样)，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张誌，
申请(专利权)人：北京金豪制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11