一种测定黄曲霉毒素B1的免疫生物传感器及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种测定黄曲霉毒素B1的免疫生物传感器及其制备方法与应用，基底电极表面依次经GO‑PB‑PTC‑NH2溶液，AuNPs溶液和黄曲霉毒素B1抗体溶液修饰，所述基底电极为玻碳电极，所述纳米金和黄曲霉毒素B1抗体通过Au‑S键共价连接。氧化石墨烯和纳米金由于具有比表面积大，电导率高，生物相容性好等特点，可达到提高免疫电极的灵敏度。相比传统抗体，纳米抗体具有体积小，溶解性好，界面稳定性好，亲和力好，优化定制，简单人性化的优点。该免疫生物传感器操作简单，成本低，可应用于食品中黄曲霉毒素B1的检测，并在食品安全分析等领域具有广泛的应用前景。

An immunobiosensor for the determination of aflatoxin B1 and its preparation and Application

The invention discloses a method for determination of aflatoxin B1 biosensor and preparation method and application thereof, the surface of the electrode substrate by using GO PB PTC NH2 solution, AuNPs solution and aflatoxin B1 antibody solution modified the substrate electrode as glassy carbon electrode, the nano gold and aflatoxin B1 Au S antibody linked by covalent. Graphene oxide and nano gold have the characteristics of high specific surface area, high conductivity and good biocompatibility, which can improve the sensitivity of the immune electrode. Compared with the traditional antibody, the nano antibody has the advantages of small volume, good solubility, good interface stability, good affinity, optimization and customization, and simple humanization. The immunobiosensor has simple operation and low cost. It can be applied to the detection of aflatoxin B1 in foods, and has wide application prospects in food safety analysis and other fields.

【技术实现步骤摘要】
一种测定黄曲霉毒素B1的免疫生物传感器及其制备方法与应用
本专利技术属于致病真菌快速检测
，具体涉及一种测定黄曲霉毒素B1的免疫生物传感器及其制备方法与应用。
技术介绍
黄曲霉毒素(AFT)是黄曲霉、寄生曲霉和曲霉菌主要产生的次生代谢物，目前是最强致癌物质之一。AFT不是单一的化合物，而是一组化学结构相似的化合物。已分离鉴定出12种，包括B1、B2、G1、G2、M1、M2等毒素和有毒醇。由于这些化合物的形成条件不同，因此它们具有不同的分布和毒性来源，其中M1和M2主要发现在牛奶中。黄曲霉毒素B1(AFB1)是目前已知的最强致癌物质，AFB1的毒性是氰化钾的10倍，是砷的68倍。同时，AFB1具有诱变，致癌和致畸作用，甚至可能导致人类和动物急性中毒死亡。据报道，AFB1的暴露可能对人体和动物造成多种系统的毒性作用，包括消化系统毒性、肝脏毒性、血液毒性、免疫毒性、生殖和发育毒性等。人类暴露于AFB1的临床症状是发烧，呕吐，腹痛和食欲不振，但观察到肝脾肿大，肝痛，皮肤黄染，腹水，下肢水肿，肝功能异常，心脏肿大和肺水肿。严重时甚至出现惊厥症状，昏迷和死亡。AFT中毒可导致贫血，黄疸，胃肠道疾病和生殖能力下降，特别是肝损伤。目前，检测AFB1的主要方法是薄层色谱(TLC)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光免疫测定和高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS)。由于这些设备价格昂贵，技术要求高，样品前处理复杂的不足，这些方法无法实现AFB1的快速检测。电化学分析方法可以简单，实时，快速的筛选鉴定，近来已成为分析检测AFB1的研究热点。氧化石墨烯(GO)具有比表面积大，导电性好，生物相容性强等优点，因此在传感器领域使用后，可获得具有优异性能的新型纳米电极。PTC-NH2具有独特的化学和电化学性质从而可以降低背景电流信号，用于修饰电极增强导电性。普鲁士蓝(PB)作为一种分子膜材料，因具有稳定性好，增强的电子传递速率和高的表面活性的优势，因此被广泛应用于光电转换，分子识别，离子选择电极，生物传感器，防腐蚀等领域。纳米抗体是一种缺失轻链只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区的天然抗体，主要存在骆驼和羊驼等外周血液中，该抗体不像人工改造的单链抗体片段(scFv)那样容易粘连甚至团聚。更重要的是单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。其具有体积小，溶解性好，界面稳定性好，亲和力好，易穿越血脑屏障和靶向效应，优化定制，简单人性化，纳米抗体在肿瘤、传染病、炎性肠病、阿尔茨海默病、血栓形成和动脉粥样硬化病等多种疾病的诊断和治疗上具有广泛的利用前景。
技术实现思路
专利技术目的：为解决现有技术存在的缺陷，本专利技术提供了一种黄曲霉毒素B1残留检测的免疫生物传感器及其制备方法。本专利技术还提供了一种黄曲霉毒素B1残留检测的免疫生物传感器检测方法，所述的方法灵敏度高、特异性好、具有很宽的线性范围和较低的检测限且成本低廉，可应用于食品中黄曲霉毒素B1的检测。本专利技术中技术术语的缩写如下：黄曲霉毒素B1:AFB1；氧化石墨烯:GO；普鲁士蓝:PB；玻碳电极:GCE；纳米金:AuNPs或GNP；苝四羧酸二酐:PTCDA；黄曲霉毒素B1纳米抗体：Nbs技术方案：本专利技术所述的一种测定黄曲霉毒素B1的免疫生物传感器的制备方法，基底电极表面依次经GO-PB-PTC-NH2溶液、AuNPs溶液和黄曲霉毒素B1抗体溶液修饰。所述AuNPs和黄曲霉毒素B1抗体通过Au-S键共价连接。优选地，所述基底电极为玻碳电极。所述GO-PB-PTC-NH2溶液按如下步骤制备：(1)将PTCDA溶解于丙酮中，加入乙二胺，室温搅拌20～60min，离心，将沉淀用乙醇、水清洗，室温干燥，得到红色粉末状PTC-NH2；(2)将GO溶解于超纯水中形成悬浊液，在悬浊液中加入FeCl3、K3[Fe(CN)6]、KCl和HCl，室温搅拌12h；再加入步骤(1)得到的PTC-NH2，室温搅拌12h，得到GO-PB-PTC-NH2溶液；所述步骤(1)中PTCDA与乙二胺的比例为1g:15mL～1g:5mL，PTCDA和丙酮的比例为1g:3mL～1g:7mL。所述步骤(2)中GO悬浮液中GO浓度为0.5～1mg/mL，GO、FeCl3、K3[Fe(CN)6]和KCl的质量比为2.1：1：1：46～8.4：1：4：46。所述步骤(2)中加入盐酸起到维持酸性环境的作用。所述步骤(2)中GO和PTC-NH2的质量比为3:1～1:3。优选地，所述步骤(2)中GO和PTC-NH2的质量比为1:1。所述AuNPs溶液按如下步骤制备：在超纯水中加入0.2～2wt.％的HAuCl4·3H2O溶液，搅拌加热至90～100℃，向其中加入0.2～2wt.％柠檬酸钠溶液，搅拌并煮沸5～25min，待变色后取出冷却，得到AuNPs溶液。优选地，所述AuNPs溶液按如下步骤制备：在超纯水加入1wt.％的氯金酸溶液，搅拌加热至95℃，向氯金酸溶液中加入1wt.％的柠檬酸钠溶液，搅拌并煮沸15min，待变色后取出冷却，得到AuNPs溶液。所述超纯水、HAuCl4·3H2O溶液和柠檬酸钠溶液的体积比为100：1：1～100：1：3。所述HAuCl4·3H2O溶液的溶剂为超纯水，柠檬酸钠溶液的溶剂为超纯水。优选地，所述黄曲霉毒素B1抗体为黄曲霉毒素B1纳米抗体。一种测定黄曲霉毒素B1的免疫生物传感器的制备方法，包括以下步骤：(1)电极预处理：将基底电极进行打磨、抛光和超声清洗；(2)将GO-PB-PTC-NH2溶液滴加到步骤(1)得到的电极表面，室温放置0.5～2h，直至GO-PB-PTC-NH2完全结合在电极表面，用PBS溶液清洗，晾干；(3)AuNPs的固定：将步骤(2)得到的电极浸泡在AuNPs溶液中，1～10℃放置1～5h，用PBS溶液清洗，晾干；(4)共价连接黄曲霉毒素B1抗体：向步骤(3)得到的电极表面滴加黄曲霉毒素B1抗体溶液，1～10℃放置6～18h，使黄曲霉毒素B1抗体和AuNPs充分连接，用PBS溶液清洗，晾干；(5)封闭非特异性位点：向步骤(4)得到的电极表面滴加BSA溶液，室温放置10～60min，封闭未被纳米抗体结合的位点，用PBS溶液清洗，晾干。所述步骤(1)中基底电极分别用0.05和0.03μmAl2O3粉末抛光，然后分别用无水乙醇、超纯水超声清洗5min。所述步骤(2)中GO-PB-PTC-NH2溶液的浓度为1～2mg/mL。GO-PB-PTC-NH2溶液是过量的，用PBS溶液清洗未结合的GO-PB-PTC-NH2。所述步骤(3)中AuNPs溶液的浓度为0.2～1mg/mL。AuNPs溶液是过量的，用PBS溶液清洗未结合的AuNPs。所述步骤(4)中黄曲霉毒素B1抗体的溶剂为0.1MPBS，浓度为1～3mg/mL。黄曲霉毒素B1抗体溶液是过量的，用PBS溶液清洗未结合的黄曲霉毒素B1抗体。所述步骤(5)中BSA溶液的溶剂为0.1MPBS，浓度为2～20mg/mL。BSA溶液是过量的，用PBS溶液清洗未结合的BSA。上述任一制备方法制备得到的免疫生物传感器。上述任一制备方法制备得到的免疫生物传感器本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定黄曲霉毒素B1的免疫生物传感器的制备方法，其特征在于，基底电极表面依次经GO‑PB‑PTC‑NH2溶液，AuNPs溶液和黄曲霉毒素B1抗体溶液修饰。

【技术特征摘要】
1.一种测定黄曲霉毒素B1的免疫生物传感器的制备方法，其特征在于，基底电极表面依次经GO-PB-PTC-NH2溶液，AuNPs溶液和黄曲霉毒素B1抗体溶液修饰。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述基底电极为玻碳电极。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述GO-PB-PTC-NH2溶液按如下步骤制备：(1)将PTCDA溶解于丙酮中，加入乙二胺，室温搅拌反应20～60min，离心，将沉淀用乙醇、水清洗，室温干燥，得到粉末状PTC-NH2；(2)将GO溶解于超纯水中形成悬浊液，在悬浊液中加入FeCl3、K3[Fe(CN)6]、KCl和HCl，室温搅拌反应12h；向其中加入步骤(1)得到的PTC-NH2，室温搅拌反应12h，得到GO-PB-PTC-NH2溶液。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中PTCDA与乙二胺的比例为1g:15mL～1g:5mL。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中GO和PTC-NH2的质量比为3:1～1:3。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述AuNPs...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈艳飞，潘登，张明明，陈慧琴，张袁健，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32