本发明专利技术公开了一种土壤微生物宏基因组DNA的提取方法及相应的试剂盒。本发明专利技术土壤微生物宏基因组DNA的提取方法是对待测土壤样品进行前处理，有效避免重金属、高盐分和低pH等对溶菌酶的影响，再通过加入溶菌酶以及结合CTAB和SDS协同两次裂解细胞，进一步的冻融处理使更多的微生物细胞壁破碎，其中的DNA分子最大限度的溶出，保证了DNA的丰度、片段完整性和纯度。本发明专利技术提取方法操作简单，实用性强，提取得到的DNA可直接应用于解析土壤微生物群落的结构和功能。本发明专利技术提取方法特别适用于提取极端环境、生物量极低的土壤微生物宏基因组DNA，且根据本发明专利技术提取方法可制成相应的DNA提取试剂盒，具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种土壤微生物宏基因组DNA的提取方法及相应的试剂盒
本专利技术属于生物基因组DNA的提取
，更具体地说，涉及一种土壤微生物宏基因组DNA的提取方法及相应的试剂盒。
技术介绍
极端环境是指具有极端高温，低温，高压，高氧，高盐，高辐射，干旱，极端酸性或碱性，高重金属含量等特征的环境。典型的极端环境包括火山，沙漠，热泉，盐湖，海底热液口，极地等。极端环境微生物类型多样，在地球上分布非常广泛，研究其生命活动具有重要的理论研究和实际应用价值。目前研究微生物的方法主要有两种，即传统的实验室纯培养法和免培养法。环境生存着大量微生物，但可培养的微生物只占1％左右，而大部分的微生物由于种种原因，是无法培养获得的。宏基因组方法通过提取样品中的总基因组，避开了微生物分离培养的问题，增加了发现新物种的机会，可以全面客观地反映样品中微生物的多样性。随着高通量测序技术的快速发展和测序成本大幅度的降低，利用宏基因组学研究极端微生物的群落结构成为微生物生态研究的一个重要内容。宏基因组学的研究对象是特定环境中全部微生物总DNA，因此DNA提取是宏基因组研究成功的关键步骤，高质量DNA获取是高通量测序的基础。用于高通量测序宏基因组研究的DNA需要满足两个条件，既要尽可能获得样品中所有微生物的基因，又要保证片段的完整度和DNA纯度。目前，用于高通量测序或者构建基因组文库的基因组DNA一般采用SDS法(十二烷基苯磺酸钠)、CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵)或基于硅胶基质的吸附离心柱等方法提取。市场上也有很多商用基因组提取试剂盒都可高效地提取细菌基因组DNA，但是这些试剂盒都是针对可培养的细菌，而针对免培养微生物效率则非常低。由于极端环境条件下微生物含量极少，而且特别是有些含有大量盐离子，极端的酸性碱性条件等严重困扰DNA的提取。采用常规DNA提取方法或普通试剂盒提取宏基因组DNA效率低，丰度欠佳，无法获得纯度高、质量优的宏基因组DNA。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：克服现有常规的极端环境土壤微生物DNA提取时存在的提取效率低、无法满足测序要求等问题，提供一种快速、简易的土壤微生物宏基因组DNA的提取方法，该方法提取得到的DNA具有高丰度、高浓度、高纯度、杂质少等优点，便于后续高通量分析。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供一种土壤微生物宏基因组DNA的提取方法，其包括如下步骤：(1)将体积比为2:3～3:2的待测土壤样品与缓冲液A混合、50～55℃孵育15～20min、离心去上清后，加入缓冲液A和溶菌酶37℃孵育30min～1h，再经20mg/ml蛋白酶K与CTAB37℃处理20～30min，然后加入浓度为20％的SDS，65～68℃裂解细胞1～2h，离心获得含DNA的上清液和沉淀；(2)在步骤(1)所得沉淀中加入缓冲液B和浓度为20％的SDS混合、65～68℃水浴15～20min然后-80℃冷冻10～15min，反复冻融三次后，离心取上清液，与步骤(1)所得上清液混合；步骤(1)所得沉淀与缓冲液B的体积比为1:3～3:2；浓度为20％的SDS与缓冲液B的体积比为1:1～9；(3)加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇抽提蛋白，再用异丙醇进行沉淀1～2h；将混合液加入到离心纯化柱中，经离心洗涤TE洗脱后收集离心管中液体，即为土壤微生物宏基因组DNA溶液；其中，所述缓冲液A的pH为8.0，包括0.1MEDTA，0.1MTris-HCl，1.5MNaCl，0.1MNaH2PO4和0.1MNa2HPO4；所述缓冲液B的pH为8.0，包括0.1MEDTA，0.1MTris-HCl，1.5MNaCl，0.1MNaH2PO4、0.1MNa2HPO4和1wt％CTAB。作为本专利技术土壤微生物宏基因组DNA的提取方法的一种优选技术方案，上述土壤微生物宏基因组DNA的提取方法，其包括如下步骤：(1)将体积比为3:2的待测土壤样品与缓冲液A混合、55℃孵育20min、离心去上清后，加入缓冲液A和溶菌酶37℃孵育30min～1h，再经20mg/ml蛋白酶K与CTAB37℃处理20min，然后加入浓度为20％的SDS，65℃裂解细胞1～2h，离心获得含DNA的上清液和沉淀；(2)在步骤(1)所得沉淀中加入缓冲液B和浓度为20％的SDS混合、65℃水浴15min然后-80℃冷冻15min，反复冻融三次后，离心取上清液，与步骤(1)所得上清液混合；步骤(1)所得沉淀与缓冲液B的体积比为1:3，浓度为20％的SDS与缓冲液B的体积比为1:5；(3)加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇抽提蛋白，再将异丙醇进行沉淀1h；将混合液加入到离心纯化柱中，经离心洗涤TE洗脱后收集离心管中液体，即为土壤微生物宏基因组DNA溶液；作为本专利技术土壤微生物宏基因组DNA的提取方法的一种优选技术方案，步骤(1)中，所述加入缓冲液A和溶菌酶37℃孵育时间为1h。作为本专利技术土壤微生物宏基因组DNA的提取方法的一种优选技术方案，步骤(1)中，所述裂解细胞的时间为2h。作为本专利技术土壤微生物宏基因组DNA的提取方法的一种优选技术方案，步骤(1)中，所述经20mg/ml蛋白酶K与CTAB37℃处理20min中，每5～10min颠倒混匀一次。作为本专利技术土壤微生物宏基因组DNA的提取方法的一种优选技术方案，步骤(3)中，所述TE洗脱的次数为多次。作为本专利技术土壤微生物宏基因组DNA的提取方法的一种更优选技术方案，步骤(3)中，所述TE洗脱的次数为3次。本专利技术土壤微生物宏基因组DNA的提取方法不仅适用于普通土壤样品，还特别适用于极端环境极低生物量的土壤样品测试。为了实现上述专利技术目的，本专利技术还提供了一种土壤微生物宏基因组DNA的提取试剂盒，其包括缓冲液A，缓冲液B，pH为8.0、浓度为50mg/ml的溶菌酶溶液，蛋白酶K，10wt％CTAB，20wt％的SDS，5MNaCl，2mMEDTA，1.2体积％的Tritonx-100异丙醇，TE缓冲液和70体积％的乙醇溶液；其中，所述缓冲液A的pH为8.0，包括0.1MEDTA，0.1MTris-HCl，1.5MNaCl，0.1MNaH2PO4和0.1MNa2HPO4；所述缓冲液B的pH为8.0，包括0.1MEDTA，0.1MTris-HCl，1.5MNaCl，0.1MNaH2PO4、0.1MNa2HPO4和1wt％CTAB。本专利技术上述土壤微生物宏基因组DNA的提取试剂盒既可用于提取普通土壤样品中的微生物宏基因组DNA，还特别适用于提取极端环境极低生物量的土壤样品中的微生物宏基因组DNA。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)手工提取法存在杂质多、容易造成基因组损失等缺陷，本专利技术提取方法是手工提取(CTAB+SDS裂解)与试剂盒提取相结合的方式，试剂盒中的吸附柱可以高效吸附DNA，弥补了手工提取法造成的基因组损失的不足，既可一次性获得较大量的DNA抽提液，又可有效提高基因组得率；(2)本专利技术提取方法先通过特定的缓冲液孵育后离心的前处理步骤，可抑制DNA的降解，螯合过多的金属离子，这是因为金属离子的存在会影响溶菌酶的活性，除去金属离子可最大限度发挥溶菌酶的作用，提高基因组的提取率；(3)本专利技术提取方法通过增大样本量从土壤(极端环境土壤)中通过溶菌酶破壁，再经蛋白酶K和本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种土壤微生物宏基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将体积比为2:3～3:2的待测土壤样品与缓冲液A混合、50～55℃孵育15～20min、离心去上清后，加入缓冲液A和溶菌酶37℃孵育30min～1h，再经20mg/ml蛋白酶K与CTAB 37℃处理20～30min，然后加入浓度为20％的SDS，65～68℃裂解细胞1～2h，离心获得含DNA的上清液和沉淀；(2)在步骤(1)所得沉淀中加入缓冲液B和浓度为20％的SDS混合、65～68℃水浴15～20min然后‑80℃冷冻10～15min，反复冻融三次后，离心取上清液，与步骤(1)所得上清液混合；步骤(1)所得沉淀与缓冲液B的体积比为1:3～3:2；浓度为20％的SDS与缓冲液B的体积比为1:1～9；(3)加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇抽提蛋白，再用异丙醇进行沉淀1～2h；将混合液加入到离心纯化柱中，经离心洗涤TE洗脱后收集离心管中液体，即为土壤微生物宏基因组DNA溶液；其中，所述缓冲液A的pH为8.0，包括0.1M EDTA，0.1M Tris‑HCl，1.5M NaCl，0.1M NaH2PO4和0.1M Na2HPO4；所述缓冲液B的pH为8.0，包括0.1M EDTA，0.1M Tris‑HCl，1.5M NaCl，0.1M NaH2PO4、0.1M Na2HPO4和1wt％CTAB。...
【技术特征摘要】
1.一种土壤微生物宏基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将体积比为2:3～3:2的待测土壤样品与缓冲液A混合、50～55℃孵育15～20min、离心去上清后，加入缓冲液A和溶菌酶37℃孵育30min～1h，再经20mg/ml蛋白酶K与CTAB37℃处理20～30min，然后加入浓度为20％的SDS，65～68℃裂解细胞1～2h，离心获得含DNA的上清液和沉淀；(2)在步骤(1)所得沉淀中加入缓冲液B和浓度为20％的SDS混合、65～68℃水浴15～20min然后-80℃冷冻10～15min，反复冻融三次后，离心取上清液，与步骤(1)所得上清液混合；步骤(1)所得沉淀与缓冲液B的体积比为1:3～3:2；浓度为20％的SDS与缓冲液B的体积比为1:1～9；(3)加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇抽提蛋白，再用异丙醇进行沉淀1～2h；将混合液加入到离心纯化柱中，经离心洗涤TE洗脱后收集离心管中液体，即为土壤微生物宏基因组DNA溶液；其中，所述缓冲液A的pH为8.0，包括0.1MEDTA，0.1MTris-HCl，1.5MNaCl，0.1MNaH2PO4和0.1MNa2HPO4；所述缓冲液B的pH为8.0，包括0.1MEDTA，0.1MTris-HCl，1.5MNaCl，0.1MNaH2PO4、0.1MNa2HPO4和1wt％CTAB。2.根据权利要求1所述的土壤微生物宏基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将体积比为3:2的待测土壤样品与缓冲液A混合、55℃孵育20min、离心去上清后，加入缓冲液A和溶菌酶37℃孵育30min～1h，再经20mg/ml蛋白酶K与CTAB37℃处理20min，然后加入浓度为20％的SDS，65℃裂解细胞1～2h，离心获得含DNA的上清液和沉淀；(2)在步骤(1)所得沉淀中加入缓冲液B和浓度为20％的SDS混合、65℃水浴15min然后-80℃冷冻15min，反复冻融三次后，离心取上清液，与步骤(1)所得上清液混合；步骤(1)所得沉...
【专利技术属性】
技术研发人员：艾红霞，束文圣，叶脉，徐卓菲，张传伦，李猛，
申请(专利权)人：广东美格基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
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