用以防治昆虫有害生物的组合物和方法技术

提供了采用沉默元件的方法和组合物，该沉默元件在被植物昆虫有害生物例如鞘翅目植物有害生物或叶甲属植物有害生物摄取时，降低靶标序列在该有害生物中的表达。披露了在本文中披露的SEQ ID NO：1‑54和81‑84中任一项所示的不同靶标多核苷酸、或其变体和片段、或其互补序列，其中降低靶标有害生物中的一种或多种序列的表达能防治该有害生物(即具有杀昆虫活性)。还提供了包含本发明专利技术的沉默元件或者其活性变体或片段的植物、植物部分、细菌和其他宿主细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用以防治昆虫有害生物的组合物和方法相关申请的交叉引用本申请要求于2015年2月27日提交的美国临时申请号62/126,151的权益，该申请通过引用以其全文结合在此。
本专利技术总体上涉及用以防治有害生物的分子生物学和基因沉默的方法。对通过EFS-Web作为文本文件提交的序列表的引用文件名为“5987SeqListing_extraLinesRemoved.txt”的序列表创建于2015年12月21日，大小为73,641字节，以计算机可读形式，同时与本说明书一起提交。该序列表是本说明书的一部分并且以其全文通过引用结合在此。专利技术背景植物昆虫有害生物是农业中的严重问题。它们破坏了数百万英亩的主要作物，如玉米、大豆、豌豆和棉花。每年，仅在美国，植物昆虫有害生物就造成了超过1000亿美元的作物损失。在与昆虫有害生物进行的季节性斗争中，农场主们必须施用数十亿加仑的合成杀有害生物剂来对付这些有害生物。过去采用的其他方法通过微生物或在转基因植物中表达来源于微生物的基因来提供杀昆虫活性。例如，已知芽孢杆菌属微生物的某些物种对于广泛范围的昆虫有害生物具有杀有害生物活性，这些昆虫有害生物包括鳞翅目、双翅目、鞘翅目、半翅目等。事实上，微生物杀有害生物剂，特别是从芽孢杆菌菌株获得的那些微生物杀有害生物剂，在农业上作为有害生物化学防治的替代方案起到重要作用。农业科学家通过对作物植物进行遗传工程改造以产生来自芽孢杆菌的杀昆虫蛋白，开发出了昆虫抗性增强的作物。例如，经遗传工程改造而产生Cry毒素的玉米和棉花植物(参见例如Aronson(2002)CellMol.LifeSci.[细胞与分子生命科学]，59(3)：417-425；Schnepf等人(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.[微生物学与分子生物学综述]62(3)：775-806)目前在美国农业中广泛应用，并给农场主提供了传统昆虫防治方法的替代方案。然而，在一些情况下，这些Bt杀昆虫蛋白可能仅保护植物免受相对较窄范围的有害生物的侵害。因此，新颖的昆虫防治组合物仍然是所希望的。
技术实现思路
提供了采用沉默元件的方法和组合物，该沉默元件在被植物昆虫有害生物(例如鞘翅目植物有害生物，包括叶甲属植物有害生物)摄取时，能够降低靶标序列在该有害生物中的表达。在特定实施例中，该靶标序列的表达降低能防治有害生物，并且因此这些方法和组合物能够限制对植物的损害。本文描述了如SEQIDNO.：1-54和81-84中所示的各种靶标多核苷酸、或者其变体或片段、或者其互补序列，其中靶标有害生物中的一个或多个序列的表达降低能防治该有害生物(即具有杀昆虫活性)。进一步提供了沉默元件，该沉默元件在被有害生物摄取时，降低这些靶标多核苷酸中的一种或多种的表达水平。还提供了包含这些沉默元件或者其活性变体或片段的植物、植物部分、植物细胞、细菌和其他宿主细胞。还提供了用于局部施用到害虫昆虫或可能存在害虫昆虫的基质上的可喷雾沉默剂的配制品。在另一个实施例中，提供了用于防治植物昆虫有害生物(例如鞘翅目植物有害生物或叶甲属植物有害生物)的方法。该方法包括向植物昆虫有害生物饲喂包含沉默元件的组合物，其中该沉默元件在被有害生物摄取时，降低该有害生物中靶标序列的水平，并且因此防治该有害生物。进一步提供了保护植物免受植物昆虫有害生物侵害的方法。此类方法包括将所披露的沉默元件引入该植物或植物部分中。当表达沉默元件的植物被有害生物摄取时，该靶标序列的水平降低并且该有害生物受到防治。附图简述图1显示了包含衣被(coatomer)片段DV-α-FRAG4的表达构建体的示意图。以相似的方式制备其他表达构建体，但是用期望的衣被片段代替DV-α-FRAG4片段。图2显示了用包含SEQIDNO：47-54的DNA构建体转化的玉米植物(8-19T0植物)中获得的温室生物测定。该图显示了与转基因阴性品系HC69相比，用指定的DNA构建体转化的玉米植物中获得的代表性数据。y轴显示了针对单个经转化的植物的CRWNIS评分。具体实施方式将在下文中参考附图更全面地描述本文的披露内容，其中示出了一些但不是所有的可能的实施例。实际上，披露内容可以以许多不同的形式体现，并且不应被解释为局限于本文所阐述的实施例；而是提供这些实施例，使得本披露能满足适用的法律要求。在全文中，同样的编号是指同样的要素。所披露的组合物和方法所涉及的领域中的技术人员将考虑到，本文所披露的许多修改和其他实施例具有前述描述和相关附图中呈现的教导的益处。因此，应当理解，这些披露内容不限于所披露的特定实施例，并且修改和其他实施例旨在包括在所附权利要求的范围内。尽管本文中采用了具体的术语，但这些术语仅在一般性和描述性意义上使用而并非用于限制目的。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定方面的目的，而不是限制性的。如在说明书和权利要求中所使用的，术语“包括”可以包括“由……组成”的方面。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与所披露的组合物和方法所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在本说明书和下面的权利要求书中，将参考本文中所定义的若干术语。I.概述通常，RNAi发现方法依赖于已知类别的敏感基因(转录因子、管家基因等)的评价。相比之下，本文所示的靶标多核苷酸的识别仅仅基于从新孵和/或3日龄中肠西方玉米根虫的cDNA文库高通量筛选所有单一序列(singleton)和所有基因簇的代表。该筛选允许发现许多新颖序列，这些序列中的许多具有与已知序列极低的同源性或无同源性。这种方法提供了对分类群中通常高度保守的基因无内在偏倚的优点。因此，已经识别出了用于RNAi的许多新颖靶标，以及先前未显示对RNAi敏感的已知基因。同样，提供了采用一个或多个沉默元件的方法和组合物，该一个或多个沉默元件在被植物昆虫有害生物(例如鞘翅目植物有害生物或叶甲属植物有害生物)摄取时，能够降低靶标序列在该有害生物中的表达。在特定实施例中，该靶标序列的表达降低能防治有害生物，并且因此这些方法和组合物能够限制对植物或植物部分的损害。本文披露了如SEQIDNO：1-54和SEQIDNO：81-84中所示的靶标多核苷酸、或其变体和片段、及其互补序列。提供了包含这些靶标多核苷酸的序列、互补序列、活性片段或变体的沉默元件，该沉默元件在被有害生物摄取或与有害生物接触时降低该靶标序列中的一者或多者的表达，并且因此能防治该有害生物(即，具有杀昆虫活性)。如本文所使用的，“防治植物昆虫有害生物”或“能防治植物昆虫有害生物”意指使植物昆虫有害生物造成的损害受到限制的对有害生物的任何影响。防治植物昆虫有害生物包括但不限于杀死该有害生物、抑制该有害生物的发育、改变该有害生物的繁殖能力或生长，以此种方式使该有害生物对植物的损害减小，或以某种方式减少所产生后代的数量、产生适应力较弱的有害生物、产生易受捕食者攻击的有害生物、产生更易受其他杀昆虫蛋白影响的有害生物、或阻止这些有害生物啃食植物。降低有害生物中的靶标多核苷酸或由其编码的多肽的表达水平使得入侵有害生物被抑制、防治和/或杀死。减少有害生物的靶标序列的表达水平将使有害生物损害减少了至少约2％至至少约6％、至少约5％至约50％、至少约10％至约60％、至少约30％至约70％、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核糖核酸构建体，该核糖核酸构建体包含至少一个双链RNA区域，该双链RNA区域的至少一条链包含与以下各项互补的多核苷酸：a.包含SEQ ID NO：1‑2、4‑8、10‑14、16‑18和20‑47中任一项的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；b.由SEQ ID NO：3、9、15、19和48‑54中任一项组成的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；c.包含与核苷酸SEQ ID NO：1‑2、4‑8、10‑14、16‑18和20‑47中任一项的至少90％序列同一性的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；d.由与核苷酸SEQ ID NO：3、9、15、19和48‑54中任一项的至少90％序列同一性组成的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；e.包含SEQ ID NO：1‑2、4‑8、10‑14、16‑18和20‑47中任一项的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；或者f.由SEQ ID NO：3、9、15、19和48‑54中任一项的至少19个连续核苷酸组成的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；其中该多核苷酸编码对鞘翅目(Coleoptera)植物有害生物具有杀昆虫活性的沉默元件。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.02.27 US 62/1261511.一种核糖核酸构建体，该核糖核酸构建体包含至少一个双链RNA区域，该双链RNA区域的至少一条链包含与以下各项互补的多核苷酸：a.包含SEQIDNO：1-2、4-8、10-14、16-18和20-47中任一项的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；b.由SEQIDNO：3、9、15、19和48-54中任一项组成的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；c.包含与核苷酸SEQIDNO：1-2、4-8、10-14、16-18和20-47中任一项的至少90％序列同一性的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；d.由与核苷酸SEQIDNO：3、9、15、19和48-54中任一项的至少90％序列同一性组成的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；e.包含SEQIDNO：1-2、4-8、10-14、16-18和20-47中任一项的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；或者f.由SEQIDNO：3、9、15、19和48-54中任一项的至少19个连续核苷酸组成的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；其中该多核苷酸编码对鞘翅目(Coleoptera)植物有害生物具有杀昆虫活性的沉默元件。2.如权利要求1所述的核糖核酸构建体，其中该鞘翅目植物有害生物是叶甲属(Diabrotica)植物有害生物。3.如权利要求2所述的RNA构建体，其中该叶甲属植物有害生物包含西方玉米根虫(D.virgiferavirgifera)、墨西哥玉米根虫(D.virgiferazeae)、南美叶甲(D.speciosa)、北方玉米根虫(D.barberi)、墨西哥玉米根虫(D.virgiferazeae)、或斑点黄瓜甲虫(D.undecimpunctatahowardi)。4.如权利要求1所述的核糖核酸构建体，其中该沉默元件包含发夹环。5.如权利要求1或4所述的核糖核酸构建体，其中该沉默元件包含，i.按照以下顺序，第一片段、第二片段和第三片段；或者ii按照以下顺序，第三片段、第二片段和第一片段；其中a.该第一片段包含与SEQIDNO：1-2、4-8、10-14、16-18和20-47中任一项所示的序列具有至少90％序列互补性的至少约19个核苷酸；或其变体和片段，及互补序列；或该第一片段由与SEQIDNO：3、9、15、19和48-54中任一项所示的序列具有至少90％序列互补性的至少19个核苷酸组成；b.该第二片段包含足够长的环，以允许该沉默元件被转录为发夹RNA；并且，c.该第三片段包含与该第一片段具有至少85％互补性的至少约19个核苷酸；其中该第二片段与SEQIDNO：1-2、4-8、10-14、16-18和20-47中任一项所示的序列或该构建体的其他片段不互补；并且其中该第一片段和该第三片段形成至少部分双链的区域。6.如权利要求5所述的核糖核酸构建体，其中该第三片段与该第一片段具有至少85％互补性。7.如权利要求5所述的核糖核酸构建体，其中该第三片段与该第一片段具有至少90％互补性。8.如权利要求5所述的核糖核酸构建体，其中该第三片段与该第一片段具有至少95％互补性。9.如权利要求5所述的核糖核酸构建体，其中该第三片段与该第一片段具有至少98％互补性。10.如权利要求5所述的核糖核酸构建体，其中该第一片段与包含西方玉米根虫的序列的至少一部分的靶标序列互补。11.如权利要求5所述的核糖核酸构建体，其中该第一片段与包含北方玉米根虫的序列的至少一部分的靶标序列互补。12.如权利要求5所述的核糖核酸构建体，其中该第一片段与包含南方玉米根虫的序列的至少一部分的靶标序列互补。13.如权利要求5所述的核糖核酸构建体，其中该第一片段与一种或多种靶标序列互补，该靶标序列包含西方玉米根虫、南方玉米根虫或北方玉米根虫的，或者这些玉米根虫中的两种或更多种的序列的至少一部分。14.如权利要求5所述的核糖核酸构建体，其中该第一片段与鞘翅目昆虫物种互补；并且其中该第三片段与不同的鞘翅目昆虫物种互补。15.一种DNA构建体，该DNA构建体包含编码如权利要求1-14中任一项所述的核糖核酸构建体的核苷酸序列。16.一种表达构建体，该表达构建体包含如权利要求15所述的DNA构建体。17.如权利要求16所述的表达盒，其中该多核苷酸有效地连接至异源启动子。18.如权利要求16所述的表达盒，其中该多核苷酸的侧翼是在该多核苷酸的一个末端处的第一经有效地连接的趋同启动子和在该多核苷酸的对向末端处的第二经有效地连接的趋同启动子，其中该第一趋同启动子和该第二趋同启动子能够驱动该多核苷酸的表达。19.一种宿主细胞，该宿主细胞包含如权利要求1-14中任一项所述的核糖核酸构建体、如权利要求15所述的DNA构建体、或如权利要求16-18中任一项所述的表达构建体。20.如权利要求19所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是细菌细胞。21.如权利要求20所述的宿主细胞，其中该细菌细胞是灭活的细菌细胞。22.如权利要求19-21中任一项所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含如权利要求16所述的表达构建体。23.如权利要求22所述的宿主细胞，其中该表达构建体包含与如权利要求15所述的DNA构建体有效地连接的转录启动子。24.如权利要求23所述的宿主细胞，其中可通过将该宿主细胞暴露于外源性分子来诱导该转录启动子。25.一种组合物，该组合物包含如权利要求1-14中任一项所述的核糖核酸构建体、如权利要求15所述的DNA构建体、如权利要求16-18中任一项所述的表达构建体、或如权利要求19-24中任一项所述的宿主细胞。26.如权利要求25所述的组合物，该组合物进一步包含农业上可接受的载体。27.如权利要求25所述的组合物，该组合物进一步包含除草剂化合物、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、农业上可接受的载体、和/或细菌，或其组合。28.如权利要求25或27所述的组合物，其中该组合物呈液体形式、固体形式或凝胶形式。29.如权利要求28所述的组合物，其中该组合物是固体形式。30.如权利要求29所述的组合物，其中该固体形式是丸剂、粉末、凝聚体或模制物品。31.一种植物细胞，其具有稳定地并入其基因组中的包含沉默元件的异源多核苷酸，其中该沉默元件包含：a.包含SEQIDNO：1-2、4-8、10-14、16-18和20-47中任一项的至少19个连续核苷酸的片段；或其变体和片段，及其互补序列；b.由SEQIDNO：3、9、15、19和48-54中任一项的至少19个连续核苷酸组成的片段；或其变体和片段，及其互补序列；c.包含与SEQIDNO：1-2、4-8、10-14、16-18和20-47中任一项的至少90％序列同一性的核苷酸序列；或其变体和片段，及互补序列；或者d.由与SEQIDNO：3、9、15、19和48-54中任一项的至少90％序列同一性组成的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；其中该沉默元件当被鞘翅目植物有害生物摄取时，防治该鞘翅目植物有害生物。32.如权利要求31所述的植物细胞，其中该鞘翅目植物有害生物是叶甲属植物有害生物。33.如权利要求31所述的植物细胞，其中该植物细胞包含如权利要求16所述的表达盒。34.如权利要求31所述的植物细胞，其中该沉默元件表达双链RNA。35.如权利要求31所述的植物细胞，其中该沉默元件表达发夹RNA。36.如权利要求31所述的植物细胞，其中该沉默元件有效地连接至异源启动子。37.如权利要求31所述的植物细胞，其中该植物细胞来自单子叶植物。38.如权利要求37所述的植物细胞，其中该单子叶植物是玉米、大麦、粟、小麦或稻。39.如权利要求31所述的植物细胞，其中该植物细胞来自双子叶植物。40.如权利要求39所述的植物细胞，其中该双子叶植物是大豆、卡诺拉、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥(Arabidopsis)或棉花。41.一种植物或植物部分，该植物或植物部分包含如权利要求31所述的植物细胞。42.一种转基因种子，该转基因种子来自如权利要求41所述的植物。43.一种用于防治植物昆虫有害生物的方法，该方法包括向植物昆虫有害生物饲喂包含编码沉默元件的多核苷酸的组合物，其中该沉默元件在被植物有害生物摄取时，防治该植物有害生物，其中该沉默元件包含：a.包含SEQIDNO：1-2、4-8、10-14、16-18和20-47中任一项的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；b.由SEQIDNO：3、9、15、19和48-54中任一项组成的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；c.包含与核苷酸SEQIDNO：1-2、...

【专利技术属性】
技术研发人员：X胡，X纽，JK佩雷斯奈尔，N里奇特曼，JZ赵，
申请(专利权)人：先锋国际良种公司，纳幕尔杜邦公司，
类型：发明
国别省市：美国,US