核酸的回收方法技术

本发明专利技术提供使用了表面吸附有水溶性的中性聚合物的氧化铝的载体的核酸的回收方法、该方法所使用的水溶性的中性聚合物吸附于表面的氧化铝的核酸回收用载体以及核酸回收用试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸的回收方法
本专利技术涉及回收核酸的方法、表面吸附有水溶性的中性聚合物的氧化铝的载体以及核酸回收用的试剂盒。
技术介绍
随着使用了核酸的实验技术的发展，新基因探索、其解析成为可能。为了特定癌症等疾病而解析人的基因组，为了特定病原体的感染而解析它们的基因组等，即使在医疗现场也进行着利用了基因解析的筛选检查、临床检查等。此外，作为基因解析的目标，不仅是基因组那样的长链核酸，而且短链核酸也备受关注。近年来发现的miRNA是18个碱基以上且25个碱基以下的单链RNA，由60个碱基以上且90个碱基以下的pre-miRNA来生物合成。它们具有调节蛋白质的合成、基因的表达的功能，因此认为与疾病有关系，作为基因解析的目标而备受关注。此外，还有如宏基因组(metagenomic)诊断法那样将临床检体中的病原体来源的数百碱基对的核酸片段用新一代测序仪包罗地解析的方法，作为新的基因解析法而备受关注。可以说现在的基因解析的目标随着基因探索的发展而多样化了。因此，伴随着基因解析的目标的多样化，核酸的回收方法也需要可以回收从miRNA那样的数十碱基的核酸直至基因组那样的长链的核酸的方法。在进行基因解析方面，首先需要的是从生物学试样回收核酸的工序。如果能够高纯度、高收率地回收核酸，则在之后的检测反应中进行高灵敏度的基因检测成为可能。作为核酸的回收方法，可举出苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀和核酸向二氧化硅的吸附等作为代表性的方法。其中最通用的方法是记载于专利文献1的、使核酸吸附于包含二氧化硅的金属氧化物，使其溶出并回收的Boom法。该方法具有下述特征：可以通过离心操作从吸附了核酸的二氧化硅回收核酸，同时进行核酸的浓缩。然而，Boom法中在核酸的吸附过程中醇等有机溶剂的使用是不可或缺的，具有回收操作的复杂化、溶剂废弃等问题。此外，还具有在离析了的核酸中混入这些有机溶剂，对之后的检测反应带来影响的问题。此外，专利文献2中记载了具有300碱基对以上且1000碱基对以下的长度的核酸对二氧化硅的吸附性不及具有更长长度的核酸，进而预想回收短的pre-miRNA、miRNA是困难的。由于基因解析在医疗现场也可利用，因此优选为不使用复杂的操作、有机溶剂，就可以回收核酸的方法。作为Boom法以外的核酸的回收方法，专利文献3和4中记载了不利用有机溶剂的核酸的回收方法。专利文献3中记载了使核酸吸附于α氧化铝粒子、氧化锆粒子、二氧化钛粒子等，进行有效率地回收的方法。此外，专利文献4中记载了使用离子交换色谱的原理，使核酸吸附，进行回收的方法，示出可以利用氧化铝作为阴离子交换材料。另一方面，专利文献5中记载了依赖于使核酸溶解的溶液，可以使核酸牢固地结合于α氧化铝和γ氧化铝，或者相反地阻止结合。此外记载了结合的核酸即使反复洗涤也几乎不溶出。现有技术文献专利文献专利文献1：美国专利第5234809号说明书专利文献2：日本特表2011-522529号公报专利文献3：国际公开第92/18514号专利文献4：日本特表2013-505719号公报专利文献5：日本特表2005-505269号公报
技术实现思路
专利技术所要解决的课题如上述那样，专利文献3或4中示出了可以使用氧化铝来有效率地回收核酸，但专利文献5中记载了结合的核酸未溶出。因此，专利技术人等研究了使用专利文献3所记载的氧化铝的核酸的回收方法。在后述的比较例1中，研究了能否准备与专利文献3的实施例4的组成尽量接近的氧化铝，参考专利文献3的条件来使核酸吸附，然后，使吸附的核酸溶出来进行回收。然而，虽然核酸吸附于氧化铝，但核酸的溶出率低，不能高收率地回收核酸。本专利技术人等基于这些结果，认为如果能够提高结合于氧化铝的核酸的溶出率，则可以利用不使用有机溶剂的简便的方法来有效率地回收核酸。用于解决课题的方法本专利技术人等发现通过使水溶性的中性聚合物吸附于氧化铝的表面，从而可以不降低核酸的吸附率，而改善核酸的溶出率。进一步，发现通过使用本专利技术，从而miRNA那样的非常短的核酸也可以效率良好地回收，从而完成本专利技术。本专利技术如下。(1)一种核酸的回收方法，其特征在于，是从生物学试样回收核酸的方法，包括以下工序：工序a)将表面吸附有水溶性的中性聚合物的氧化铝的载体与包含核酸的溶液进行混合，使核酸吸附于载体的工序，工序b)从工序a)中混合后的溶液，分离出吸附有上述核酸的载体的工序，工序c)向工序b)中分离出的吸附有上述核酸的载体添加溶出液来回收核酸的工序。(2)根据(1)所述的核酸的回收方法，其特征在于，上述水溶性的中性聚合物是在pH7的溶液中具有-10mV以上且+10mV以下的ζ电位的聚合物。(3)根据(1)或(2)所述的核酸的回收方法，其特征在于，上述聚合物为聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚(2-乙基-2-唑啉)或羟基丙基甲基纤维素。(4)根据(1)～(3)中的任一项所述的核酸的回收方法，其特征在于，上述溶出液为缓冲液。(5)根据(1)～(4)中的任一项所述的核酸的回收方法，其特征在于，上述生物学试样为血液、尿、唾液、粘膜、汗、培养细胞、培养细胞的培养液、组织试样或标本。(6)一种核酸回收用的载体，其在氧化铝的载体的表面吸附有水溶性的中性聚合物。(7)根据(6)所述的载体，其特征在于，上述水溶性的中性聚合物是在pH7的溶液中具有-10mV以上且+10mV以下的ζ电位的聚合物。(8)根据(6)或(7)所述的载体，其特征在于，上述水溶性的中性聚合物为聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚(2-乙基-2-唑啉)或羟基丙基甲基纤维素。(9)根据(6)～(8)中的任一项所述的载体，其特征在于，上述水溶性的中性聚合物以被覆氧化铝的载体的表面中的7％以上的方式吸附着。(10)一种核酸回收用的试剂盒，其特征在于，具备(6)～(9)中的任一项所述的载体和缓冲液。专利技术的效果通过本专利技术，即使使用氧化铝作为载体，也能够不使用有机溶剂，而以简便的方法高收率地回收核酸；进一步也能够以高收率回收迄今为止难以有效率地回收的pre-miRNA、miRNA等非常短的核酸。具体实施方式本专利技术所使用的生物学试样可以使用包含核酸的任意的试样。核酸中，可举出例如，RNA、DNA、RNA/DNA(嵌合体)和人工核酸等。DNA中，可举出cDNA、基因组DNA和合成DNA等。此外，RNA中，可举出总RNA、mRNA、rRNA、miRNA、siRNA、snoRNA、snRNA或非编码RNA、它们的前体或合成RNA等。合成DNA和合成RNA可以基于规定的碱基序列(天然型序列或非天然型序列的任一种都可以)，使用例如自动核酸合成机，人工地制作。作为生物学试样，可以利用例如，培养细胞、培养细胞的培养液、组织试样、标本等细胞来源试样，细菌、病毒等微生物来源试样，体液、大小便等包含人的动物来源试样，除了核酸以外还包含蛋白质、糖、脂质等具有生物学功能的化合物的溶液等，不限定于此。上述生物学试样优选为培养细胞、体液，进一步优选为血液。血液包括全血、血浆、血清、血细胞等。在这些生物学试样为体液等液体试样的情况下，可以在采集后直接适用本专利技术，也可以在采集后添加溶液进行稀释。在生物学试样为细胞团块、组织切片等固体试样的情况下，可以在采集后用水、缓冲液进行稀释后用于本专利技术。生物学试样可以根据需要进行以下那样的处理。这是因为通常核本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸的回收方法，其特征在于，是从生物学试样回收核酸的方法，包括以下工序：工序a)将表面吸附有水溶性的中性聚合物的氧化铝的载体与包含核酸的溶液进行混合，使核酸吸附于载体的工序，工序b)从工序a)中混合后的溶液，分离出吸附有所述核酸的载体的工序，工序c)向工序b)中分离出的吸附有所述核酸的载体添加溶出液来回收核酸的工序。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.20 JP 2015-0577601.一种核酸的回收方法，其特征在于，是从生物学试样回收核酸的方法，包括以下工序：工序a)将表面吸附有水溶性的中性聚合物的氧化铝的载体与包含核酸的溶液进行混合，使核酸吸附于载体的工序，工序b)从工序a)中混合后的溶液，分离出吸附有所述核酸的载体的工序，工序c)向工序b)中分离出的吸附有所述核酸的载体添加溶出液来回收核酸的工序。2.根据权利要求1所述的核酸的回收方法，其特征在于，所述水溶性的中性聚合物是在pH7的溶液中具有-10mV以上且+10mV以下的ζ电位的聚合物。3.根据权利要求1或2所述的核酸的回收方法，其特征在于，所述聚合物为聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚(2-乙基-2-唑啉)或羟基丙基甲基纤维素。4.根据权利要求1～3中的任一项所述的核酸的...

【专利技术属性】
技术研发人员：关口翔太，泽田慎二郎，
申请(专利权)人：东丽株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP