基于免疫生物条形码的肠毒素B检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及食品安全检测免疫分析技术领域，具体涉及基于免疫生物条形码的肠毒素B检测试剂盒及检测方法。该试剂盒包括以下组分：(1)磁珠；(2)抗SEB单克隆抗体；(3)抗SEB多克隆抗体；(4)金纳米粒子；(5)捕获DNA，能够与金纳米粒子形成共价连接；(6)条形码DNA；其中，所述捕获DNA中的至少一部分与条形码DNA互补配对。本发明专利技术的试剂盒和方法具有灵敏度高、检测范围宽、操作简单、特异性好等优点，对肠毒素B的超灵敏检测具有重要的实际意义，对于实现现场快速、超灵敏侦检技术具有很好的指导意义。

Detection kit and method for detection of enterotoxin B based on immune biological bar code

The invention relates to the technical field of food safety detection and immunoassay, in particular to the enterotoxin B detection kit and the detection method based on the immune biological bar code. The kit comprises the following components: (1) magnetic beads; (2) SEB monoclonal antibody; (3) polyclonal antibody against SEB (4); gold nanoparticles; (5) acquisition of DNA, capable of forming covalent connection with gold nanoparticles (6); among them, the bar code DNA; capture in DNA at least a portion of the bar code and DNA pairing. The kit and method of the invention has the advantages of high sensitivity, wide detection range, simple operation and good specificity, which has important practical significance for the hypersensitive detection of enterotoxin B, and has good guiding significance for realizing on-site fast and ultra sensitive detection technology.

【技术实现步骤摘要】
基于免疫生物条形码的肠毒素B检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及食品安全检测免疫分析
，更具体地，涉及一种基于免疫生物条形码的肠毒素B检测试剂盒及基于免疫生物条形码的肠毒素B检测方法。
技术介绍
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是引起细菌性食品中毒的重要细菌，广泛存在于空气、水及食物中，金黄色葡萄球菌引起的细菌性中毒事件主要是其分泌SEB等细胞外毒素所致，金黄色葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcalenterotoxin，SEB)是由血浆凝固酶或金黄色葡萄球菌所产生的肠毒素系列之一，分子量约26.30KDa。SEB常在饮料、肉制品、牛奶及大多数乳制品中出现，是一种可溶性蛋白质，耐热，经100℃煮沸30min结构不被破坏，也不受胰蛋白酶的影响，误食被肠毒素污染的食物会引起急性胃肠炎，引发恶心、呕吐、腹部痉挛等，国际上已将肠毒素的检测列为食品安全检测的一项重要研究内容。与此同时，由于制作成本低、污染面积大，传播方式多样，肠毒素是用来作为生物战剂的主要毒素之一。目前已建立起的肠毒素B的检测方法主要包括动物学实验、分子生物学检测方法、免疫学检测方法等，其中以免疫学检测方法为主，包括免疫扩散法、凝集试验、放射性免疫测定、酶联免疫吸附、免疫荧光、化学发光酶联免疫检测等。ELISA作为传统的检测方法已经在部分地区广泛使用，但在实际样品(如乳制品、肉制品、血液)的检测过程中，容易受到食品或人体血液中复杂成分的影响，从而使得该方法在灵敏度的检测上仍存在一定的缺陷。因此，建立食品中金黄色葡萄球菌肠毒素的高灵敏度检测方法对于消费者健康及该菌引起食物中毒的临床诊断具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于免疫生物条形码的肠毒素B检测试剂盒及基于免疫生物条形码的肠毒素B检测方法，利用该试剂盒或该检测方法，能够高灵敏的检测金黄色葡萄球菌肠毒素。为了实现上述目的，本专利技术提供一种基于免疫生物条形码的肠毒素B检测试剂盒，该试剂盒包括以下组分：(1)磁珠；(2)抗SEB单克隆抗体；(3)抗SEB多克隆抗体；(4)金纳米粒子；(5)捕获DNA，能够与金纳米粒子形成共价连接；(6)条形码DNA；其中，所述捕获DNA中的至少一部分与条形码DNA互补配对。本专利技术的原理是采用“三明治”夹心结构的生物条形码免疫分析模式，形成“MMP-单抗/肠毒素/多抗-AuNPs-条形码DNA三明治”结构复合体，每一个金纳米颗粒表面修饰有上百条DNA条形码，通过加热使DNA条形码从复合体中释放出来，利用荧光定量PCR检测DNA含量实现对肠毒素的间接定量。基于上述原理，所述捕获DNA与条形码DNA既要具有一定互补配对能力，又要能够解链用于后续检测，优选地，所述捕获DNA与条形码DNA形成的互补配对双链DNA的Tm值为65-70℃，进一步优选为67.5-69℃。本专利技术可以采用任何能够实现上述目的的捕获DNA与条形码DNA。优选地，所述捕获DNA具有SEQIDNO：1所示的碱基序列，并且，3’端连接有-SH基团(5'-TACGAGTTGAGACCGTTAAGACGAGGCAATCATGCAATCCTGAATGCGAAAAAAAAAA-SH-3')，可通过-SH基团实现与金纳米粒子的共价连接。优选地，所述条形码DNA具有SEQIDNO：2(5'-CGCATTCAGGATTGCATGATTGCCTCGTCTTAACGGTCTCAACTCGTA-3')所述的碱基序列。根据本专利技术，所述磁珠的直径为2.5-3.0μm，所述金纳米粒子的直径为10-15nm。特定尺寸的磁珠能够进一步提高检测的灵敏度。特定尺寸的金纳米粒子能够满足修饰的要求。根据本专利技术，所述磁珠和所述抗SEB单克隆抗体可分别提供，也可以以磁珠偶联抗SEB单克隆抗体的形式提供。所述磁珠偶联抗SEB单克隆抗体可采用本领域常规的方法制得，例如，利用2.8μm磁性微球和抗SEB单克隆抗体制备。本专利技术还提供一种基于免疫生物条形码的肠毒素B检测方法，该方法包括以下步骤：(1)获取磁珠偶联抗SEB单克隆抗体；(2)获取金纳米粒子检测探针，所述金纳米粒子检测探针包括金纳米粒子、与所述金纳米粒子连接的抗SEB多克隆抗体以及与所述金纳米粒子连接的双链DNA，所述双链DNA包括捕获DNA和条形码DNA，所述捕获DNA与金纳米粒子共价连接；所述捕获DNA中的至少一部分与条形码DNA互补配对。根据本专利技术，所述捕获DNA与条形码DNA既要具有一定互补配对能力，又要能够解链用于后续检测，优选地，所述捕获DNA与条形码DNA形成的互补配对双链DNA的Tm值为65-70℃，优选为67.5-69℃。所述捕获DNA和所述条形码DNA的优选实施方式如上所述。所述磁珠偶联抗SEB单克隆抗体可采用本领域常规的方法制得，例如，利用2.8μm磁珠和抗SEB单克隆抗体制备。所述磁珠与所述抗SEB单克隆抗体的相对用量可以根据需要调整，优选地，以1mL磁珠计，所述磁珠上偶联的抗SEB单克隆抗体为2.0-4.0μg，优选为3.2-3.8μg。本专利技术中，所述抗SEB单克隆抗体和多克隆抗体可以在实验室采用常规的免疫方法制备，也可直接从公司购买。所述多克隆抗体例如可以为羊抗SEB多克隆抗体。根据本专利技术，获取金纳米粒子探针的方法优选如下：采用柠檬酸钠还原法制备金纳米粒子，捕获探针5’端修饰有巯基(-SH)，能够在胶体金表面形成Au-S键，DNA条形码与捕获探针通过碱基互补配对杂交结合。取制备好的胶体金纳米粒子，加入羊抗SEB多克隆抗体，常温下于涡旋振荡器下反应。加入捕获探针进行反应，为了降低胶体金与DNA的分子间斥力作用，分次加入一定量的NaCl溶液进行盐化。离心弃上清，用含BSA的PBS洗涤，继续重复离心两次。将DNA条形码复溶后加入胶体金中进行杂交。重复离心，使用含BSA的PBS复溶，制得所需的金纳米粒子检测探针。根据本专利技术一种具体实施方式，采用柠檬酸钠还原法制备13nm左右粒径金纳米粒子，捕获探针5’端修饰有巯基(-SH)，能够在胶体金表面形成Au-S键，DNA条形码通过与捕获探针通过碱基互补配对杂交结合。取5mL制备好的胶体金纳米粒子，加入1mL，194μg/mL的羊抗SEB多克隆抗体，常温下于涡旋振荡器下反应1h。加入1OD捕获探针，4℃下反应16h，为了降低胶体金与DNA的分子间斥力作用，分次加入一定量的10％NaCl溶液，使NaCl溶液的终浓度为0.1M，整个盐化过程持续40h。13000rpm离心20min，轻轻将上清液吸取弃掉，用1mL1％的BSA的PBS(0.1M,pH7.4)，继续重复离心两次。将1OD条形码DNA复溶后加入胶体金中，37℃下杂交4h。重复离心过程3次，使用含有1％BSA的PBS复溶，制备得所需的金纳米粒子检测探针。根据本专利技术，所述检测所述游离的条形码DNA的浓度优选通过荧光定量PCR完成，所用引物可通过常规方法设计。对于上述优选的条形码DNA序列，所述引物优选具有SEQIDNO：3(5'-CGCATTCAGGATTGCATGAT-3')和SEQIDNO：4(5'-TACGAGTTGAGACCGTTAAG-3')所示核苷酸序列。本专利技术的试剂盒和方法具有灵敏度高、检测范围宽、操作简本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于免疫生物条形码的肠毒素B检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下组分：(1)磁珠；(2)抗SEB单克隆抗体；(3)抗SEB多克隆抗体；(4)金纳米粒子；(5)捕获DNA，能够与金纳米粒子形成共价连接；(6)条形码DNA；其中，所述捕获DNA中的至少一部分与条形码DNA互补配对。

【技术特征摘要】
1.一种基于免疫生物条形码的肠毒素B检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下组分：(1)磁珠；(2)抗SEB单克隆抗体；(3)抗SEB多克隆抗体；(4)金纳米粒子；(5)捕获DNA，能够与金纳米粒子形成共价连接；(6)条形码DNA；其中，所述捕获DNA中的至少一部分与条形码DNA互补配对。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述捕获DNA与条形码DNA形成的互补配对双链DNA的Tm值为65-70℃。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述捕获DNA具有SEQIDNO：1所示的碱基序列，并且，3’端连接有-SH基团；所述条形码DNA具有SEQIDNO：2所述的碱基序列。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述磁珠的直径为2.5-3.0μm，所述金纳米粒子的直径为10-15nm。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述磁珠和所述抗SEB单克隆抗体以磁珠偶联抗SEB单克隆抗体的形式提供。6.一种基于免疫生物条形码的肠毒素B检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)获取磁珠偶联抗SEB单克隆抗体；(2)获取金纳米粒子检测探针，所述金纳米粒子检测探针包括金纳米粒子...

【专利技术属性】
技术研发人员：高志贤，宁保安，白家磊，王江，李双，彭媛，霍冰洋，孙思明，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12