牛布鲁氏菌病荧光标记免疫层析试纸条制造技术

本发明专利技术提供了一种牛布鲁氏菌病荧光标记免疫层析试纸条，属于蛋白质工程技术领域。本发明专利技术试纸条是在硝酸纤维素膜(NC膜)上包被牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28的混合抗原和羊抗兔IgG、兔抗羊IgG，在玻璃纤维素膜上包被荧光标记的兔抗牛IgG、羊抗牛IgG，检测标本中的牛布鲁氏菌抗体，本发明专利技术试纸条操作简单、方便、快速，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，易于推广，适合基层，适合于现场检测和流行病学调查，对牛布鲁氏菌感染诊断起到辅助作用，具有良好的市场应用前景。

Fluorescent labeled immunochromatographic strip for detection of bovine brucellosis

The invention provides a bovine brucellosis fluorescence immunochromatographic test strip, which belongs to the technical field of protein engineering. The test strip of the invention is on nitrocellulose membrane (NC membrane) was coated on the Brucella outer membrane protein OMP19, OMP22, OMP28 mixed antigen and Goat anti rabbit IgG, Rabbit anti goat IgG, packet labeled Rabbit anti bovine IgG and Goat anti bovine IgG in glass fibre membrane, bovine brucella antibody test specimens the test strip of the invention has the advantages of simple operation, convenient, fast, does not require special equipment, without professional training, the clear, easy popularization, suitable for basic, suitable for field detection and epidemiological investigation, diagnosis of bovine Brucella infection plays an auxiliary role, with good market prospects.

【技术实现步骤摘要】
牛布鲁氏菌病荧光标记免疫层析试纸条
本专利技术涉及蛋白质工程
，具体地，涉及一种以牛布鲁氏菌外膜蛋白为检测抗原的牛布鲁氏菌并荧光标记免疫层析试纸条。
技术介绍
布鲁氏菌病是一种在世界范围内影响严重的人畜共患病。布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的，主要侵害动物的生殖系统，引起流产和不孕不育，带来严重的经济损失。确诊布病的诊断方法是对致病微生物的分离培养鉴定。目前在血清学诊断方法上，大部分都是基于检测抗布鲁菌脂蛋白(脂多糖，LPS)的抗体，虽然虎红平板凝集和补体结合实验在世界范围内最认可和接受的测试，但是由于实验结果有交叉性，实验操作步骤繁琐、费时等诟病，在实际操作中应用较少。基于检测布鲁氏菌LPS的ELISA方法不能区分自然感染和疫苗感染的缺陷。因此很有必要研发一种既不使用全菌也不使用脂蛋白LPS的诊断抗原。外膜蛋白OMP，不仅是布鲁氏菌结构蛋白和功能蛋白，而且也是布鲁氏菌重要的抗原和毒力因子，对维持布鲁氏菌细胞膜的完整性和选择性至关重要。然而遗憾的是在布鲁氏菌如何生存和致病力感染中，外膜蛋白OMP起到的作用尚未被人知晓。外膜蛋白OMP28已经被全面的研究了，在作为ELISA诊断抗原上具有较好的反应原性和特异性，也可以作为候选疫苗。但将OMP19、OMP22、OMP28多种蛋白混合后用于布鲁氏菌的诊断还未有研究报道。在布鲁氏菌病一般的检测方法中，细菌分离等试验虽然作为检测布鲁氏菌病的金标准，但是它们耗时长；酶联免疫吸附试验(ELISA)和一些分子生物学方法也同样要求有专业实验室作为试验进行的保障，这些作为实验室检测的传统试验方法，它们的优点给畜牧业前期的发展带来了不可磨灭的功绩。但随着社会的不断进步，人民物质生活不断地丰富，高速的发展导致进出口检验检疫额度的不断增加。所以这就要求口岸检验检疫工作者重新开发一些新的技术去改善这些敏感性低、易发生交叉反应、耗时长、不易操作等的缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种牛布鲁氏菌病荧光标记免疫层析试纸条。本专利技术通过以下技术方案实现：首先构建包含牛布鲁氏菌外膜蛋白基因OMP19、OMP22、OMP28的表达载体，通过将三种基因的表达载体分别转化入感受态细胞，得到牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28表达工程菌；经IPTG诱导表达；将表达产物过镍-NTA琼脂糖树脂层析柱，洗脱得到纯化的牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28。选取了牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28，将它们组合作为包被抗原，将荧光标记的二抗IgG喷涂于结合垫上，建立一种检测牛布鲁氏菌病荧光标记免疫层析试纸条方法，并将它初步应用于临床样品的检测中。进一步地，本专利技术提供的牛布鲁氏菌病荧光标记免疫层析试纸条，含有硝酸纤维素膜和玻璃纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上包被牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28三者的混合抗原和二抗IgG；所述玻璃纤维素膜包括样品垫和结合释放垫，结合释放垫上包被荧光标记的二抗IgG。优选地，本专利技术试纸条上，硝酸纤维素膜上二抗IgG为羊抗兔IgG和兔抗羊IgG。优选地，本专利技术试纸条上结合释放垫上包被荧光标记的二抗IgG为兔抗牛IgG和羊抗牛IgG。本专利技术发现羊抗牛IgG可以与牛血清很好地反应，在待选择的所有抗体中，此抗体效价较高；且与兔抗羊IgG很好地结合故选择这两个二抗。所述混合抗原中OMP19浓度为0.4mg/mL、OMP22浓度为0.8mg/mL、OMP28浓度1.5mg/mL。本专利技术试纸条所使用的牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28已在中国专利CN105445473A中公开。优选地，本专利技术试纸条中硝酸纤维膜上的兔抗羊IgG浓度为0.5mg/ml。优选地，本专利技术试纸条中玻璃纤维素膜上包被的荧光标记的兔抗牛IgG浓度为0.5mg/ml，荧光标记的羊抗牛IgG浓度为0.75mg/ml。本专利技术经过反复对比试验，发现硝酸纤维素膜为HFC13502检测线显示颜色深，便于视读。硝酸纤维素膜HFC13502为上海捷宁生物有限公司的产品。优选地，本专利技术选用结合释放垫为8964型号的玻璃纤维素膜，样品垫为GF-08型号的玻璃纤维素膜。均为上海捷宁生物有限公司的产品。进一步地，本专利技术还提供了牛布鲁氏菌病荧光标记免疫层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：(1)制备牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28；(2)硝酸纤维膜的制备：将牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28三种抗原的混合物喷于硝酸纤维膜上，形成检测线，OMP19浓度为0.4mg/mL、OMP22浓度为0.8mg/mL、OMP28浓度1.5mg/mL；将羊抗兔IgG和兔抗羊IgG浓度为0.5mg/ml喷于硝酸纤维膜上，形成控制线，且于37℃中干燥2小时，备用；(3)玻璃纤维膜的制备：包括样品垫和结合释放垫，结合释放垫上包被1mg/ml荧光标记的兔抗牛IgG和0.75mg/mL的羊抗牛IgG；(4)最后在PVC底板上依次相互搭接玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜和吸水垫。目前，用IDEXX试剂盒对布鲁氏菌病进行ELISA检测，往往是其他检测技术的对照方法。因此，专利技术人在试验中，同样使用IDEXX试剂盒检测作为对照试验，检测牛布鲁氏菌病血清，然后将两者进行符合率的计算。经对200份牛血清样品检测结果显示，本专利技术的荧光免疫层析试纸条与IDEXX试剂盒检测方法的符合率为93.5％，说明本专利技术的牛布鲁氏菌病荧光标记免疫层析试纸条在实际应用过程中，与IDEXX试剂盒ELISA检测方法的使用效果基本相同。综合来看，本专利技术建立的牛布鲁氏菌病荧光标记免疫层析试纸条方法的检测速度和便利性良好，可以应用在牛布鲁氏菌病大量筛查工作中。附图说明图1为rOMP19重组蛋白SDS-PAGE电泳分析图，M.蛋白分子质量标准，1.重组表达菌裂解液上清，2.重组表达菌裂解液沉淀，3纯化的重组蛋白。图2为rOMP22重组蛋白SDS-PAGE电泳分析图，M.蛋白分子质量标准，1.重组表达菌裂解液上清，2.重组表达菌裂解液沉淀，3.纯化的重组蛋白。图3为rOMP28重组蛋白SDS-PAGE电泳分析图，M.蛋白分子质量标准，1.重组表达菌裂解液上清，2.重组表达菌裂解液沉淀，3.纯化的重组蛋白。图4为本专利技术试纸条组装示意图。图5为底板对比情况图，其中1.普通底板，2.黑色底板，3.进口底板。图6为荧光抗体显色情况图，1.荧光标记兔抗牛IgG，2.荧光标记羊抗牛IgG。图7为抗体反应对比图，其中，1.荧光标记的兔抗牛IgG，2.荧光标记的羊抗牛IgG。图8为NC膜处理结果对比图，1.未处理的NC膜，2.处理过的NC膜。图9为抗体浓度优化结果图。图10为标准血清验证结果对比图，其中，1.阳性标准血清，2.阴性标准血清。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。以下实施例的材料和试剂情况如下：牛布病标准阴阳性血清由中国兽医药品监察所提供，被检牛血清来自天津某养殖场96份本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛布鲁氏菌病荧光标记免疫层析试纸条，其特征在于，含有硝酸纤维素膜和玻璃纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上包被牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28三者的混合抗原和二抗IgG；所述玻璃纤维素膜包括样品垫和结合释放垫，结合释放垫上包被荧光标记的二抗IgG。

【技术特征摘要】
2016.06.30 CN 20161050994361.一种牛布鲁氏菌病荧光标记免疫层析试纸条，其特征在于，含有硝酸纤维素膜和玻璃纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上包被牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28三者的混合抗原和二抗IgG；所述玻璃纤维素膜包括样品垫和结合释放垫，结合释放垫上包被荧光标记的二抗IgG。2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，硝酸纤维素膜上二抗IgG为羊抗兔IgG和兔抗羊IgG。3.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，结合释放垫上包被荧光标记的二抗IgG为兔抗牛IgG和羊抗牛IgG。4.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述混合抗原中OMP19浓度为0.4mg/mL、OMP22浓度为0.8mg/mL、OMP28浓度1.5mg/mL。5.如权利要求1-4任一所述的试纸条，其特征在于，硝酸纤维膜上的兔抗羊IgG浓度为0.5mg/ml。6.如权利要求1-4任一所述的试纸条，其特征在于，玻璃纤维素膜上包被的荧光标记的兔抗牛IgG浓度为0.5mg/ml...

【专利技术属性】
技术研发人员：王慧煜，吴绍强，韩雪清，林祥梅，梅琳，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11