一种检测临床抑郁情绪及抑郁症的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种可应用于抑郁情绪或抑郁症检测试剂或检测试剂盒中的血清microRNA，miR‑221‑3p，并通过基因工程体外转录得到miR‑221‑3p的标准品和血清中miR‑221‑3p的绝对含量与抑郁情绪或抑郁症患者血清中miRNA‑221‑3p荧光定量PCR测定的Ct值所对应的标准曲线，简化了抑郁症检测的程序。本发明专利技术提供了一种基于血清microRNA的临床抑郁情绪及抑郁症的检测试剂盒，加入了miR‑221‑3p标准品，检测简单，灵敏度高、特异性强，结果准确，具有良好的临床抑郁情绪及抑郁症检测能力。

Kit for detecting depression and depression in clinic and its application

The invention provides a method which can be applied to depression or depression detection reagent kit or the serum microRNA, miR 221 3P, and through gene engineering in vitro transcription obtained standard and serum miR 221 3P miR 221 3P absolute content and depression or depression in patients with miRNA in 221 3P fluorescence quantitative PCR determination of the Ct value of the standard curve, simplifies the detection procedure of depression. The invention provides a detection kit for clinical depression and depression of serum based on microRNA, joined the miR 221 3P standard, simple detection, high sensitivity, strong specificity, accurate result, with mood and depression clinical depression good detection capability.

【技术实现步骤摘要】
一种检测临床抑郁情绪及抑郁症的试剂盒及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种检测临床抑郁情绪及抑郁症的试剂盒及其应用。
技术介绍
抑郁症(Majordepression)是以情绪低落、快感缺乏和兴趣丧失等精神心理症候群为主要表现并伴有其他心理和躯体症状的情感障碍。抑郁症的临床表现差异很大，其主要的临床表现可以分为核心症状和伴随症状(心理症状群和躯体症状群)两大类。抑郁的核心症状包括心境或情绪低落，兴趣缺乏以及乐趣丧失，这是抑郁的关键症状。其中，情绪低落是指病人体验到情绪低、悲伤；兴趣缺乏是指病人对各种以前喜爱的活动缺乏乐趣；乐趣丧失是指病人无法从生活中体验到乐趣，或快感缺失(Anhedonia)。以上三种主征是相互联系的，可以同时出现或只以其中某一、二种突出。目前，抑郁症的发病机理尚不清楚，其诊断手段也没有针对抑郁症和抑郁情绪的特异性检查项目，其诊断和疗效的判断主要是基于患者的症状描述、精神状态检查和临床行为学观察，缺乏可靠的具有临床诊断意义的生物学指标，导致较高的漏诊、误诊。由于持续性心理障碍至少出现两周，严重状态甚至至少持续两年才能确认，目前的诊断缺少快速，灵敏的指标，难以在短时间内确认患者是否患有该病或已发病，更没有措施进行早期预防，避免悲剧的发生。开发准确而客观的抑郁症实验室诊断和疗效评价方法将对我国抑郁症的防治工作起到极大的推动作用。
技术实现思路
本专利技术公开了一种用于检测患者抑郁情绪及抑郁症的血清特异性microRNA：miR-221-3p，其序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的目的之一在于提供一种基于血清microRNA的临床抑郁情绪及抑郁症的检测试剂盒，用于检测miR-221-3p在抑郁情绪及抑郁症患者血清中的含量。本专利技术的目的之二在于提供一种microRNA在血清抑郁情绪及抑郁症检测试盒中的应用，所述血清microRNA为miR-221-3p，其序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术通过采集围术期无抑郁情绪患者、轻度抑郁情绪患者、中重度抑郁情绪患者和临床诊断为抑郁症的患者血液，使用荧光定量PCR方法，检测miR-221-3p的相对表达量的变化，并制备标准品，根据标准曲线，计算miR-221-3p在不同个体样本中的绝对拷贝数，将抑郁情绪评分(PHQ-9)与miR-221-3p绝对含量进行相关性分析，得出血清中较高浓度miR-221-3p的绝对含量对抑郁情绪及抑郁症的判断有临床指导意义。经供血者同意后，根据用PHQ9抑郁量表评定的抑郁患者的抑郁程度，将供血者分为无抑郁组(n＝22)，轻度抑郁组(n＝20)和中度及以上组(n＝22)。分别抽取三组供血者的静脉血：无抑郁组静脉血22份、轻度抑郁组静脉血20份、中度及以上组静脉血22份，室温凝固，离心取血清，用TIRzolLS试剂提取血清RNA，用miR-221-3p颈环反转录特异引物进行反转录，miRNA-423-5p作为参照基因，颈环反转录特异性引物为miR-423-5p-RT，其序列号如SEQIDNO.2所示。反转录得到cDNA后，用miR-221-3p荧光定量PCR检测特异性引物：miR-221-3p-F、miR-221-3p-R和参照基因miR-423-5p引物miR-423-5p-F、miR-423-5p-R，进行荧光定量PCR检测各组样品。实验相关指标均以均数±标准差的形式表示；以miR-423-5p为内参，无抑郁组为基准；P值代表各样品血清miR-221-3p相对含量差异，由独立样本t检验得出。结果发现血清中miR-221-3p在无抑郁组、轻度抑郁组、中度及以上组中相对表达量分别为：1.14±1.01、2.52±2.27、4.19±3.54，表明血清中miR-221-3p基因的含量可以很好的指示抑郁情绪。但上述检测方法是一种相对定量的检测方法，每次判断患者是否存在抑郁，均需要与正常个体进行比较，不便于临床抑郁症患者的辅助判断；本专利技术通过基因工程的方法，构建含有miR-221-3p基因片段的重组质粒，通过体外转录得到miR-221-3p的标准品RNA，制定出标准曲线，通过荧光定量PCR测定结果，可以计算出miR-221-3p在血清中的绝对含量，这样就不需要与正常个体进行比较，也能够清楚的界定miR-221-3p在患者血清中的含量。一种基于血清microRNA的临床抑郁情绪及抑郁症的检测试剂盒，包括RNA提取试剂，RNA反转录试剂，SRYBGreen染料，所述试剂盒还包括用于扩增miR-221-3p基因的miR-221-3p颈环反转录特异引物、miR-221-3p标准品以及miR-221-3p荧光定量PCR检测特异性引物。所述miR-221-3p颈环反转录特异引物为miR-221-3p-RT，其序列如SEQIDNO.2所示。所述miR-221-3p荧光定量PCR检测特异性引物为：miR-221-3p-F和miR-221-3p-R，其序列号分别为：miR-221-3p-F：5’GGGAAGCUACAUUGUCUGC3’；miR-221-3p-R：5’CAGUGCGUGUCGUGGAGU3’。所述RNA提取试剂为TIRzolLS试剂。所述miR-221-3p标准品的制备方法为：步骤A：以miR-221-3p的反转录产物为模板，用引物miR-221-BamHI-F和miR-221-EcoRI-R进行扩增获得带有BamH1和EcoR1酶切位点并含有miR-221-3p的基因片段，其序列号如SEQIDNO.3所示；将得到的基因片段与pcDNA3.1质粒同时用BamH1和EcoR1进行双酶切，纯化后进行酶切连接反应，最后转化到大肠杆菌感受态细胞中，通过菌落PCR和基因测序最终确定构建miR-221-3p重组质粒构建成功；步骤B：以步骤A中经测序验证构建成功的pcDNA3.1-miRNA-221-3p重组质粒为模板，用引物CMV-F和BGH进行PCR扩增得到含有T7RNA聚合酶启动子和miRNA-221-3p序列的DNA片段,其序列如SEQIDNO.4所示；步骤C：将步骤B所得的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳DNA片段提取纯化后，作为转录模板，用T7体外转录试剂盒进行体外转录，去除DNA模板后，再通过RNA提取试剂盒纯化获取RNA沉淀即为miR-221-3p标准品。所述体外转录的体系包括：RNase-free水、NTP缓冲液、模板DNA、T7RNA聚合酶。所述体外转录包括以下步骤：a：将体系中的各组分充分混匀后37℃孵育2h，进行DNA片段体外转录。b：将步骤a得到的产物在70℃加热10分钟灭活T7RNA聚合酶。c：将步骤b得到的转录产物加入2μl无RNA酶的Dnase-I酶，混匀后37℃孵化15min，去除DNA模板。利用实时荧光定量PCR对梯度稀释后的标准品进行扩增，分析结果，以标准品系列稀释后的Ct值为横坐标，相对应的拷贝数为纵坐标建立标准曲线如，得到其对应方程式为：Y＝3.49214E+12e-0.5871X，R2＝0.9999，Y代表样品的拷贝数，X代表样品的Ct值。根据前述标准曲线方程，已知各样品Ct值对应的血清miRNA-221-3p的绝对含量，使抑郁症或者抑郁情绪患者可通过荧光定量PCR测定的血清中miRNA-221-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测临床抑郁情绪及抑郁症的试剂盒，其特征在于：包括RNA提取试剂，RNA反转录试剂，SRYB Green染料，其特征在于：所述试剂盒还包括用于扩增miR‑221‑3p基因的miR‑221‑3p颈环反转录特异引物、miR‑221‑3p标准品以及miR‑221‑3p荧光定量PCR检测特异性引物。

【技术特征摘要】
1.一种检测临床抑郁情绪及抑郁症的试剂盒，其特征在于：包括RNA提取试剂，RNA反转录试剂，SRYBGreen染料，其特征在于：所述试剂盒还包括用于扩增miR-221-3p基因的miR-221-3p颈环反转录特异引物、miR-221-3p标准品以及miR-221-3p荧光定量PCR检测特异性引物。2.根据权利要求1所述的一种检测临床抑郁情绪及抑郁症的试剂盒，其特征在于：所述miR-221-3p颈环反转录特异引物为miR-221-3p-RT。3.根据权利要求1所述的一种检测临床抑郁情绪及抑郁症的试剂盒，其特征在于：所述miR-221-3p荧光定量PCR检测特异性引物为：miR-221-3p-F和miR-221-3p-R，其序列分别为：miR-221-3p-F：5’GGGAAGCUACAUUGUCUGC3’；miR-221-3p-R：5’CAGUGCGUGUCGUGGAGU3’。4.根据权利要求1所述的一种检测临床抑郁情绪及抑郁症的试剂盒，其特征在于：所述RNA提取试剂为TIRzolLS试剂。5.根据权利要求1~4任一项所述的一种检测临床抑郁情绪及抑郁症的试剂盒，其特征在于：所述miR-221-3p标准品的制备方法为：步骤A：以miR-221-3p的反转录产物为模板，用引物miR-221-BamHI-F和miR-221-EcoRI-R进行扩增获得带有BamH1和EcoR1酶切位点并含有miR-2...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓斌，冯建国，李茂，刘力，
申请(专利权)人：西南医科大学附属医院，
类型：发明
国别省市：四川,51