快速鉴定转基因三文鱼及其制品的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速鉴定转基因三文鱼及其制品的方法，属于分子生物学鉴定转基因产品的检测技术，具体地说是用实时荧光PCR技术检测食品中转基因三文鱼的快速检测方法。方法包括PCR扩增反应液和外源启动子MAP上游引物F661:5’‑ccctgtctcagcttgctttt‑3’和下游引物R 853:5’‑attagctgactgcctgcaca‑3’；外源基因OTGH上游引物F523:5’‑tgagcctggatgacaatgac‑3’和下游引物R 720:5’‑cccacgtctacagagtgcag ‑3’。转基因三文鱼的快速检测方法包括鱼肉制品DNA的提取、转基因三文鱼外源基因基因的实时荧光PCR扩增和使用熔解曲线进行结果判定。其优点是快速、特异性强、灵敏度高、操作简便。

Method for rapid identification of genetically modified salmon and its products

The invention discloses a method for rapid identification of genetically modified salmon and its products, detection technology belongs to the molecular biology identification of genetically modified products, in particular to a method for rapid detection of genetically modified food salmon detection technique of real-time PCR in. The method includes PCR reaction liquid and exogenous promoter MAP F661:5 'ccctgtctcagcttgctttt upstream primer and downstream primer R 3' 853:5 'attagctgactgcctgcaca 3'; OTGH gene upstream primer F523:5 tgagcctggatgacaatgac '3' and '720:5 downstream primer R cccacgtctacagagtgcag 3'. The real-time PCR method for rapid detection of transgenic fish products including salmon DNA, salmon foreign gene transgenic extraction of gene amplification and the results were determined using melting curve. The advantages of this method are rapid, specific, sensitive and easy to operate.

【技术实现步骤摘要】
快速鉴定转基因三文鱼及其制品的方法
本专利技术涉及一种用实时荧光PCR技术检测转基因三文鱼及其制品的方法，属于分子生物学鉴定转基因产品的检测技术。
技术介绍
AquAdvantage三文鱼是美国AquaBountyTechnologies公司的研究人员将大西洋三文鱼、太平洋奇努克三文鱼(ChinookSalmon，Oncorhynchustshawytscha)以及大洋鳕鱼(OceanPout，Macrozoarcesamericanus)三种鱼进行基因杂交改造，培育出来的一种三文鱼品种。其具体做法是，在大西洋三文鱼的受精卵中植入从奇努克三文鱼体内提取的生长激素基因（OTGH）序列，以及从大洋鳕鱼体内提取的抗冻蛋白基因（外源启动子MAP）。这种转基因三文鱼的身材要比普通野生三文鱼大得多。转基因三文鱼的快速生长能力可以降低养殖成本，它的环境适应能力又意味着三文鱼可以在邻近陆地甚至居民区的地方养殖，既方便供应，也减少了运输上的二氧化碳排放。由于公众对转基因的产品的知情权和进出口贸易的需要，需要知道三文鱼是否是转基因三文鱼。
技术实现思路
本专利技术属于分子生物学鉴定转基因产品的检测技术，具体地说是用实时荧光PCR技术检测食品中转基因三文鱼的快速检测方法。克服基于形态学的检测方法在鱼类产品加工过程中带来的鉴定困难，为确定转基因三文鱼的种源提供技术手段，从而确保食品标签的一致性。本专利技术的主要原理为：针对保守序列设计两组引物：MAP上游引物F661:5’-ccctgtctcagcttgctttt-3’和下游引物R853:5’-attagctgactgcctgcaca-3’；外源基因OTGH上游引物F523:5’-tgagcctggatgacaatgac-3’和下游引物R720:5’-cccacgtctacagagtgcag-3’。利用裂解液破碎细胞，三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板进行PCR扩增；测定熔解曲线时，在反应体系中加入荧光染料EvaGreen，染料与DNA双链结合并发出荧光，由于反应中存在少量的非特异聚合体（如引物二聚体等），能引起干扰，但非特异聚合体的熔解温度较特异性结合低，当扩增结束后，再缓慢加温，当DNA变性后，染料被释放，荧光减少，而非特异性结合先于特异性结合减少，对熔解过程进行连续动态监测可得熔解曲线，通过曲线将非特异性讯号和特异性讯号区分出来，同时对特异性讯号区，荧光减少的快慢与浓度的对数成正比，以此可以确定是否有引物特异性扩增产物。本专利技术涉及的转基因三文鱼种源快速检测方法，其中的试剂包括如下：（1）PCR扩增反应液包括10×PCR反应缓冲液、0.1－0.4mmol/LdNTP、2－4mmol/L硫酸镁、1－2UTaq酶、0.2－0.6µmol/L上游引物、0.2－0.6µmol/L下游引物、1.25mL20×EvaGreen染料（美国Biotum公司）；其中10×PCR反应缓冲液含有100mmol/LpH8.8的三羟基甲基氨基甲烷－盐酸、500mmol/L氯化钾和1％曲拉通X－100；外启动子源启动子MAP上游引物F661:5’-ccctgtctcagcttgctttt-3’和下游引物R853:5’-attagctgactgcctgcaca-3’。外源基因OTGH上游引物F523:5’-tgagcctggatgacaatgac-3’和下游引物R720:5’-cccacgtctacagagtgcag-3’。其中上游引物、下游引物体积比为：1:1。使用上述试剂盒检测食品中转基因三文鱼的方法，依次包括下列步骤（1）-（4）：（1）待检样品DNA的提取DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取试剂盒。DNA提取质量使用OD260和OD280的光吸收来衡量，或者使用其他方法衡量。（2）转基因三文鱼外源启动子MAP的实时荧光PCR扩增：在装有24μL的PCR扩增反应液的反应管中加入1μL的待检样品DNA，混匀。按照下述步骤完成PCR扩增。94-95℃2-4min,1个循环；94-95℃10-60s,60℃10-60s,共40个循环；95℃15s,60℃15s,20min内升温至95℃，95℃15s。（3）使用熔解曲线分析外源启动子MAP的PCR产物。外源启动子MAP的PCR产物的熔解曲线的单一熔解峰出现在81±1℃，判为MAP启动子阳性。（4）外源基因OTGH的实时荧光PCR扩增：在装有24μL的PCR扩增反应液的反应管中加入1μL的待检样品DNA，混匀。按照下述步骤完成PCR扩增。94-95℃2-4min,1个循环；94-95℃10-60s,60℃10-60s,共40个循环；95℃15s,60℃15s,20min内升温至95℃，95℃15s。（5）使用熔解曲线分析外源基因OTGH的PCR产物。外源基因OTGH的PCR产物的熔解曲线的单一熔解峰出现在82±1℃，判为OTGH基因阳性。若是MAP启动子和OTGH基因同时为阳性检出，则可以判定该鱼或者鱼制品为转基因三文鱼。本专利技术的有益效果：本专利技术建立了转基因三文鱼种源的实时荧光PCR检测方法及检测方法。本专利技术采用实时荧光PCR技术，该技术特异性强、灵敏度高、操作简便，特别适用于一些成分复杂的鱼肉制品中转基因三文鱼种源的检测。附图说明图1是外源启动子MAP的鱼肉样品PCR产物的熔解曲线图。图中的单一峰分别为外源启动子MAP，没有出峰的线是空白对照。图2是含有OTGH基因的鱼肉样品PCR产物的熔解曲线图。图中的单一峰分别为外源OTGH基因，没有出峰的线是空白对照。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步说明。实施例1本实施例提供的转基因三文鱼种源快速检测方法，其中的试剂包括如下：（1）PCR扩增反应液包括10×PCR反应缓冲液、0.1－0.4mmol/LdNTP、2－4mmol/L硫酸镁、1－2UTaq酶、0.2－0.6µmol/L上游引物、0.2－0.6µmol/L下游引物、1.25mL20×EvaGreen染料（美国Biotum公司）；其中10×PCR反应缓冲液含有100mmol/LpH8.8的三羟基甲基氨基甲烷－盐酸、500mmol/L氯化钾和1％曲拉通X－100；外启动子源启动子MAP上游引物F661:5’-ccctgtctcagcttgctttt-3’和下游引物R853:5’-attagctgactgcctgcaca-3’。外源基因OTGH上游引物F523:5’-tgagcctggatgacaatgac-3’和下游引物R720:5’-cccacgtctacagagtgcag-3’。其中上游引物、下游引物体积比为：1:1。使用上述试剂盒检测食品中转基因三文鱼的方法，依次包括下列步骤（1）-（4）：（1）待检样品DNA的提取DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取试剂盒。DNA提取质量使用OD260和OD280的光吸收来衡量，或者使用其他方法衡量。（2）转基因三文鱼外源启动子MAP的实时荧光PCR扩增：在装有24μL的PCR扩增反应液的反应管中加入1μL的待检样品DNA，混匀。按照下述步骤完成PCR扩增。94-95℃2-4min,1个循环；94-95℃10-60s,60℃10-60s,共40个循环；9本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组转基因三文鱼实时荧光PCR鉴定引物，其特征在于，引物序列如下：外源启动子MAP上游引物F661:5’‑ ccctgtctcagcttgctttt‑3’；外源启动子MAP下游引物R 853 :5’‑ attagctgactgcctgcaca‑3’；外源基因OTGH上游引物F523:5’‑ tgagcctggatgacaatgac ‑3’；外源基因OTGH下游引物R 720 :5’‑ cccacgtctacagagtgcag ‑3’。

【技术特征摘要】
1.一组转基因三文鱼实时荧光PCR鉴定引物，其特征在于，引物序列如下：外源启动子MAP上游引物F661:5’-ccctgtctcagcttgctttt-3’；外源启动子MAP下游引物R853:5’-attagctgactgcctgcaca-3’；外源基因OTGH上游引物F523:5’-tgagcctggatgacaatgac-3’；外源基因OTGH下游引物R720:5’-cccacgtctacagagtgcag-3’。2.一种快速鉴定转基因三文鱼及其制品的方法，其特征在于，依次包括下列步骤：待检样品的DNA提取；转基因三文鱼外源启动子MAP的实时荧光PCR扩增：在装有24μL的PCR扩增反应液的反应管中加入1μL的待检样品DNA，混匀；按照下述步骤完成PCR扩增：94-95℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：高宏伟，魏晓棠，刘涛，孙雯娴，陈盛盛，林青宇，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：山东,37