球形孢子丝菌STR分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术涉及球形孢子丝菌STR分子标记及其应用。本发明专利技术首次提供一套球形孢子丝菌的微卫星位点(STR分子标记)组合，其中共包括25个高度多态的微卫星位点(SEQ ID NO:1‑25)。同时，提供了一套能够高效扩增球形孢子菌群体的特导性引物(SEQ ID NO:26‑75)和检测条件。这一套球形孢子丝菌的微卫星标记，不仅可以用于球形孢子丝菌的遗传背景分析和分子溯源，同时也可应用于球形孢子丝菌的分子流行病学、群体遗传学和系统进化分析。

STR molecular marker and its application in the analysis of filamentous fungi

The present invention relates to the STR molecular marker and its application. The present invention is a spherical s.schenckii microsatellite loci (STR markers), which includes a total of 25 microsatellite loci were highly polymorphic (SEQ ID NO:1 25). At the same time, provides a set of efficient amplification of spherical spores group specific primers (SEQ ID guide NO:26 75) and detection conditions. This set of microsatellite markers can be used not only for the genetic background analysis and molecular tracing, but also for the molecular epidemiology, population genetics and phylogenetic analysis of the fungus.

【技术实现步骤摘要】
球形孢子丝菌STR分子标记及其应用
本专利技术涉及分子生物学检测
，具体地说，涉及球形孢子丝菌STR分子标记及其应用。
技术介绍
孢子丝菌病是一种亚急性或慢性的皮下组织真菌感染，主要表现为皮肤、皮下组织及其附近淋巴系统的慢性肉芽肿性病变，可经血液、淋巴系统扩散累及心、肺、脑等脏器，具有一定的致残率和致死率。在我国，孢子丝菌病是仅次于念珠菌病和曲霉病的深部真菌病，主要流行于东三省，但在全国范围均有分布。引起孢子丝菌病的主要病原真菌包括：申克孢子丝菌(Sporothrixschenckii)、球形孢子丝菌(Sporothrixglobosa)、巴西孢子丝菌(Sporothrixbrasiliensis)、墨西哥孢子丝菌(Sporothrixmexicana)、白孢子丝菌(Sporothrixalbicans)及申克孢子丝菌卢艾里变种(Sporothrixschenckiivar.luriei)。各个菌种在地理分布、毒力及对抗真菌药物敏感性等方面存在差异。早期的形态学分析认为，我国孢子丝菌病的病原体主要是申克孢子丝菌，而最新的资料则表明，我国孢子丝菌病的病原体主要是球形孢子丝菌。目前，用于球形孢子丝菌主要分子标记仍然是ITS、beta-tublin、Calmodulin等，但这些序列的种内多态性较低，无法满足球形孢子丝菌的分子溯源、群体遗传学和分子流行病学研究等工作的需要。因此，本专利技术所提供的种内高度多态的微卫星位点标记及其扩增方法，具体重要的意义。微卫星，有时称为SSR(simplesequencerepeats)，STR(shorttandemrepeats)，VNTR(variablenumbertandemrepeats)，指基因组DNA上的串联重复序列，重复单元一般为1-6bp，重复次数一般为5-40次。此为核心区域，而在其两侧有相对保守的侧翼序列。通过在保守的侧翼序列设计PCR引物，检测PCR产物的长度，可以进行遗传多态性分析。该检测方法具有多态性高，特异性好，共显性遗传，成本低，通量高等优点，因此在分子生态学、分子育种等方面已有着比较广泛的应用。而在病原真菌方面，目前应用相对较少，其中一个重要原在于真菌中的微卫星位点相对较少，获得微卫星位点信息的难度较大。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供球形孢子丝菌STR分子标记及其应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供的球形孢子丝菌STR分子标记，所述STR分子标记为SEQIDNO:1-25所示序列中的任一个。本专利技术还提供球形孢子丝菌STR分子标记组合，所述STR分子标记组合为上述STR分子标记中的任意两个或多个组合。本专利技术还提供用于检测上述STR分子标记的引物或试剂盒。25个STR分子标记对应的引物序列分别如SEQIDNO:26-75所示。其中，SEQIDNO:1所示序列的STR分子标记对应的引物序列为SEQIDNO:26-27，SEQIDNO:2所示序列的STR分子标记对应的引物序列为SEQIDNO:28-29，SEQIDNO:3所示序列的STR分子标记对应的引物序列为SEQIDNO:30-31，以此类推。本专利技术还提供所述STR分子标记单独或组合使用在球形孢子菌的分子分型、分子溯源、分子流行病学、群体遗传学和系统进化分析中的应用。本专利技术还提供所述STR分子标记的检测方法，包括以下步骤：(1)提取球形孢子菌的基因组DNA；(2)合成SEQIDNO:25-75所示的引物，并使用荧光染料对正向引物5'端进行标记，获得荧光标记的引物组；(3)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用步骤(2)荧光标记的引物组进行PCR扩增；每个PCR管加入一对引物；(4)对扩增产物中的单色荧光标记DNA片段进行多态性检测。PCR反应体系为：2×PremixTaq(TAKARA，货号R004Q)10ul，10uM正、反向引物各1ul，纯水7ul，DNA模板1ul。PCR程序为：95℃5min；95℃30sec，56-62℃(表1)30sec，72℃40sec，33个循环；72℃5min。表1球形孢子丝菌的微卫星座位本专利技术进一步提供非诊断目的球形孢子丝菌检测方法，包括以下步骤：(1)提取待测样品DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用SEQIDNO:25-75所示的引物进行PCR扩增；每个PCR管加入一对引物；(3)分析PCR扩增产物。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：本专利技术首次提供一套球形孢子丝菌的微卫星位点(STR分子标记)组合，其中共包括25个高度多态的微卫星位点(SEQIDNO:1-25)。同时，提供了一套能够高效扩增球形孢子菌群体的特导性引物(SEQIDNO:26-75)和检测条件。这一套球形孢子丝菌的微卫星标记，不仅可以用于球形孢子丝菌的遗传背景分析和分子溯源，同时也可应用于球形孢子丝菌的分子流行病学、群体遗传学和系统进化分析。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1球形孢子丝菌STR位点的筛选/获得及引物设计基于球形孢子丝菌的基因组测序结果(GenBank：LVYW00000000.1)，利用SciRoKo软件从基因组测序数据中分离出微卫星座位200个。经过筛选后，通过Primerpremier5.0软件设计了微卫星的相关引物共150对，并通过e-PCR对相关引物进行了初步验证。选择一株球形孢子丝菌，通过梯度PCR，对上述引物进行验证(同时判定其合适的退火温度)，其中107对引物能够稳定扩增。任选10株来源不同的球形孢子丝菌，进行遗传多态性检测后，最终得到25个能稳定扩增，且条带清晰的STR位点，具体如表1所示。实施例2球形孢子丝菌的种群遗传多样性检测1、球形孢子丝菌的基因组DNA提取用购自北京康为世纪生物科技有限公司的酵母基因组DNA提取试剂盒(CW0569S)完成22株球形孢子丝菌的基因组DNA提取，操作流程参照试剂盒说明书进行。22株球形孢子丝菌由北京大学真菌和真菌病研究中心提供。2、微卫星PCR扩增利用本专利技术的微卫星位点特异性引物对步骤中所提取的22个球形孢子丝菌样品进行扩增。对球形孢子丝菌的微卫星标记特异引物进行荧光标记，方法为使用荧光染料对正向引物5'端进行FAM标记。PCR反应体系为20ul，其中包括2×PremixTaq(TAKARA，货号R004Q)10ul，正、反向引物(10uM)各1ul，纯水7ul，DNA模板1ul。PCR程序为：95℃5min；95℃30sec，56-62℃(具体见表1)30sec，72℃40sec，33个循环；72℃5min。3、利用ABI3730测序仪对扩增出的单色荧光标DNA片段进行多态性检测。检测结束后，使用GeneMarkerv2.2进行位点分析。然后，以Cervus3.0和GenAlEx6.41对所得的群体数据进行计算，并对25个位点进行评估。结果如表2所示。表2球形孢子丝菌的微卫星位点的基本信息注：a，有效本文档来自技高网...

【技术保护点】
球形孢子丝菌STR分子标记，其特征在于，所述STR分子标记为SEQ ID NO:1‑25所示序列中的任一个。

【技术特征摘要】
1.球形孢子丝菌STR分子标记，其特征在于，所述STR分子标记为SEQIDNO:1-25所示序列中的任一个。2.球形孢子丝菌STR分子标记组合，其特征在于，所述STR分子标记组合为权利要求1所述STR分子标记中的任意两个或多个组合。3.用于检测权利要求1所述STR分子标记的引物或试剂盒。4.根据权利要求3所述的引物，其特征在于，25个STR分子标记对应的引物序列分别如SEQIDNO:26-75所示。5.权利要求1所述STR分子标记单独或组合使用在球形孢子菌的分子分型、分子溯源、群体遗传学和系统进化分析中的应用。6.权利要求1所述STR分子标记的检测方法，其特片在于，包括以下步骤：(1)提取球形孢子菌的基因组DNA；(2)合成SEQIDNO:25-75所示的引物，并使用荧光染料对...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚杰，李若瑜，张建中，何利华，万喆，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：北京,11