检测T790M基因突变的荧光PCR体系、方法及试剂盒技术

本发明专利技术检测T790M基因突变的荧光PCR体系、方法及试剂盒。该体系主要包括引物对、检测突变探针、检测野生型探针，如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示。所述探针5’‑端标记发光基团FAM、HEX、VIC、JOE、CY3或TAMRA；所述探针3’‑端标记淬灭基团BHQ或TAMRA。（1）本发明专利技术荧光PCR体系特异性好、敏感性高。（2）本发明专利技术引入了LNA修饰的封闭野生型的LNA探针，使得可以在高背景下检测低拷贝，提了高荧光PCR检测低拷贝突变的能力。本发明专利技术不依赖于昂贵的分析设备及仪器，检测成本，操作简便，易于做成试剂盒推广普及。

Fluorescent PCR system, method and kit for detecting T790M gene mutation

The fluorescence PCR system, method and kit for detecting T790M gene mutation in the invention. This system mainly includes primer pairs, mutation detection probe, detection of wild type probe, such as SEQ ID NO.1 to SEQ ID NO.4 shown. The 5 'end labeled probe groups FAM, HEX, El VIC, JOE, CY3 or TAMRA; the 3' end labeled probe quencher BHQ or TAMRA. (1) the fluorescence PCR system of this invention has good specificity and high sensitivity. (2) the present invention introduces a LNA modified closed wild type LNA probe, which enables low copy detection in high background, and raises the ability of high fluorescence PCR to detect low copy mutations. The invention does not depend on expensive analytical equipment and instruments, has simple detection cost, easy operation, and is easy to be popularized and popularized.

【技术实现步骤摘要】
检测T790M基因突变的荧光PCR体系、方法及试剂盒
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种检测T790M基因突变的荧光PCR体系、方法及试剂盒。
技术介绍
肺癌是当今最常见的恶性肿瘤之一，也是高致死率的癌症之一，其中80～85%的患者为非小细胞肺癌（non-smallcelllungcancers，NSCLC）。以EGFR为靶点小分子靶向药物，在非小细胞肺癌治疗中日渐突出。但并非所有肺癌患者从TKI治疗获益，EGFR突变与TKI疗效相关。携带EGFR基因突变的NSCLC患者在接受易瑞沙和特罗凯治疗时疗效显著，但EGFR外显子20上的T790M位点和插入为耐药位点，会抑制易瑞沙和特罗凯等的药物疗效。对T790M突变监测，最佳途径是检测外周血游离DNA中基因T790M突变。而现有的检测方法，有的依赖于昂贵的检测仪器设备，有的检测方法不够灵敏，有的依赖于丰富的经验和高超的技巧；当前迫切需要有一种检测方法既操作简便、成本低，其检测灵敏度又高。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种检测外周血中游离DNAEGFR基因T790M突变的荧光PCR体系、方法及试剂盒，其可提高荧光PCR检测低拷贝突变的能力。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：设计一种检测T790M基因突变的荧光PCR体系，包括如下引物和探针（如SEQIDNO.1至SEQIDNO.4所示）：引物TM-F:CCGTGCAGCTCATCAT引物TM-R:TCCCTTCCCTGATTACCTT检测突变探针TM-P1:CTCAT+CA+TG+CAGCT检测野生型探针TM-P2:CTCAT+CA+CG+CAGCT，其中“+”表示锁核酸修饰（LNA）。所述探针5’-端标记发光基团FAM、HEX、VIC、JOE、CY3或TAMRA等；所述探针3’-端标记淬灭基团BHQ或TAMRA等。设计一种检测T790M基因突变的方法，包括如下步骤：（1）合成所述引物和探针；（2）配制荧光PCR反应体系：Buffer5μLMg2+1.0～5mmol/L，dNTP100～1000nmol/L，所述引物100～500nmol/L，所述探针100～1000nmol/L，TaqDNA聚合酶1U～3UDNA模板5～10ng；加水补足至50微升；（3）荧光PCR扩增：酶激活，95℃2min；突变富集，95℃15s，58℃45s并收集荧光信号，共45个循环；（4）结果判定：阴性对照无“S”曲线；阳性对照有“S”曲线，且Ct值小于32；样本孔FAM通过观察到曲线，且Ct值小于40。所述DNA模板包括外周血游离DNA。一种检测T790M基因突变的的试剂盒，包括所述引物和/或探针。本专利技术的有益技术效果在于：（1）本专利技术荧光PCR体系特异性好、敏感性高。（2）本专利技术引入了LNA修饰的封闭野生型的LNA探针，使得可以在高背景下检测低拷贝，提了高荧光PCR检测低拷贝突变的能力。（3）本专利技术不依赖于昂贵的分析设备及仪器，检测成本，操作简便，易于做成试剂盒推广普及。附图说明图1是检测含T790M突变样本的扩增图谱；图2是检测阴性样本的扩增图谱。具体实施方式下面结合附图和实施例来说明本专利技术的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术的范围。在以下实施例中所涉及的试验仪器如无特别说明，均为常规仪器；所涉及的试剂原料如无特别说明，均为市售常规产品；所涉及的操作方法或步骤，如无特别说明，均为常规步骤。实施例一：检测T790M基因突变的荧光PCR体系，包括如下引物和探针：引物TM-F:CCGTGCAGCTCATCAT引物TM-R:TCCCTTCCCTGATTACCTT检测突变探针TM-P1:CTCAT+CA+TG+CAGCT检测野生型探针TM-P2:CTCAT+CA+CG+CAGCT，其中“+”表示锁核酸修饰。所述探针5’-端标记发光基团FAM、HEX、VIC、JOE、CY3或TAMRA；所述探针3’-端标记淬灭基团BHQ或TAMRA。实施例二：应用T790M突变检测试剂盒检测外周血中T790M突变试验1.样本收集和处理（1）从肺非小细胞癌患者外周血中提取DNA，采用EDTA抗凝管，每位抽取4ml静脉血。（2）将收集的新鲜外周血离心800g离心10分钟；将上清移入无核酸酶污染的离心管中。（3）8000g离心5分钟，取上清于无核酸酶污染的离心管中，-80℃保存，备用。2.外周游离DNA提取：采用QiagenBloodDNAminikit提取DNA，具体操作如下：（1）取1ml分离好的血，加入等体积的裂解液ATL和蛋白酶K（20mg/ml），充分混匀。（2）56℃孵育30分钟。（3）加入等体积的AL、50mg1微米超顺磁珠和等体积的无水乙醇，充分混匀，70℃10分钟，每隔两分钟混匀一次。（4）将样本放置于磁力架上，静置2分钟，去掉液体，加入500微升洗涤液1（WB1）洗涤一次。（5）加入500微升洗涤液2（WB1）充分混匀，磁力架上静置后，去掉液体。（6）加入500微升无水乙醇，充分混匀，磁力架上静置后，去掉液体后静置5分钟。（7）加入50～100微升洗脱液、生理盐水或无菌水，充分混匀，56℃5分钟，磁力架上静置2分钟，收集液体。3.加样：（1）阳性和阴性参考品，8000rpm离心2分钟后，加入500微升水溶解。（2）准备荧光PCR反应体系Buffer5μLMg2+3mmol/L，dNTP500nmol/L，所述引物500nmol/L，所述探针300nmol/L，TaqDNA聚合酶3U，加水补足至50微升，冻干。按照样本数（n）、阳性参考品、阴性参考品和PCR参考品准备反应体系，即n=3。（3）分别向冻干的八联排荧光PCR体系中加入50微升样本、阳性参考品、阴性参考品和洗脱液（或生理盐水或无菌水）。（4）盖好管盖瞬时离心，上机。4.扩增程序：1）95℃：10分钟；2）95℃：15秒，58℃45秒并收集荧光信号，共45循环；5.结果分析：1）阴性对照无“S”曲线；2）阳性对照有“S”曲线，且Ct值小于32；3）共10例样本，检测结果与数字PCR检测结果完全一致，因此，采用此方法开发的T790M检测试剂盒，其检测的灵敏性高，且检测成本低、操作简便，可以替代数字PCR向临床推广。上面结合附图和实施例对本专利技术作了详细的说明，但是，所属
的技术人员能够理解，在不脱离本专利技术宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本专利技术的常见变化范围，在此不再一一详述。SEQUENCELISTING<110>郑州大学第一附属医院<120>检测T790M基因突变的荧光PCR体系、方法及试剂盒<130>/<160>4<170>PatentInversion3.2<210>1<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>1ccgtgcagctcatcat16<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>2tcccttccctgattacc本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测T790M基因突变的荧光PCR体系，包括如下引物和探针：引物TM‑F: CCGTGCAGCTCATCAT引物TM‑R: TCCCTTCCCTGATTACCTT检测突变探针TM‑P1: CTCAT+CA+TG+CAGCT检测野生型探针TM‑P2: CTCAT+CA+CG+CAGCT，其中“+”表示锁核酸修饰。

【技术特征摘要】
1.一种检测T790M基因突变的荧光PCR体系，包括如下引物和探针：引物TM-F:CCGTGCAGCTCATCAT引物TM-R:TCCCTTCCCTGATTACCTT检测突变探针TM-P1:CTCAT+CA+TG+CAGCT检测野生型探针TM-P2:CTCAT+CA+CG+CAGCT，其中“+”表示锁核酸修饰。2.根据权利要求1所述的荧光PCR体系，其特征在于，所述探针5’-端标记发光基团FAM、HEX、VIC、JOE、CY3或TAMRA；所述探针3’-端标记淬灭基团BHQ或TAMRA。3.一种检测T790M基因突变的方法，包括如下步骤：（1）合成权利要求1所述引物和探针；（2）配制荧光PCR反应体系：Buffer5μL...

【专利技术属性】
技术研发人员：王峰，周悦，许瀚，李晟磊，陈晓琦，
申请(专利权)人：郑州大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：河南,41