水稻育性恢复基因辅助育种分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术提供水稻育性恢复基因辅助育种分子标记，所述分子标记是分别与水稻育性恢复基因Rf3及Rf4共分离的SNP标记RSRF30121、FRF4‑10‑01。标记RSRF30121检测水稻第1号染色体5606898位碱基，标记FRF4‑10‑01检测水稻第10号染色体18838172位碱基；基于KASP技术开发的标记RSRF30121的引物序列如SEQ ID NO:1‑3所示；基于KASP技术开发的标记FRF4‑10‑01的引物序列如SEQ ID NO:4‑6所示。本发明专利技术还提供SNP标记RSRF30121、FRF4‑10‑01在水稻育性恢复基因辅助选择育种中的应用。采用本发明专利技术的标记组合能够快速鉴定水稻是否含有育性恢复基因，对促进Rf3和Rf4育性恢复基因在商业化育种中的应用具有重要意义。

Molecular marker assisted breeding for fertility restoration in rice and its application

The present invention provides rice restorer gene molecular marker assisted breeding, the molecular marker is respectively and rice fertility restorer gene Rf3 and Rf4 were isolated from the SNP markers RSRF30121, FRF4 10 01. RSRF30121 marker detection of rice chromosome first 5606898 bases, 10 marker FRF4 01 detection of rice chromosome tenth 18838172 base primers; based on KASP technology development RSRF30121 3 markers is shown as SEQ ID NO:1; KASP technology development FRF4 10 01 marker primer sequences such as SEQ ID 6 shows based on NO:4. The invention also provides SNP, FRF4 10 marker RSRF30121 01 in rice fertility selection and application in breeding gene assisted recovery. The invention of the combination of markers for rapid identification of rice containing fertility restorer gene, Rf3 and Rf4 to promote the application of fertility restoring gene in commercial breeding has important significance in.

【技术实现步骤摘要】
水稻育性恢复基因辅助育种分子标记及其应用
本专利技术涉及分子生物学及作物育种
，具体地说，涉及水稻育性恢复基因辅助育种分子标记及其应用。
技术介绍
分子标记辅助选择育种是现代生物技术与传统育种技术相结合的产物，它使育种技术由传统的粗放型，经验型向现代的精准型转变，使育种变得更加具有可操作性及可预见性。在三系杂交水稻育种中，根据恢保关系的不同，细胞质雄性不育类型主要有三类，野败型(WA-CMS)、包台型(BT-CMS)和红莲型(HL-CMS)。多数研究者认为水稻野败型细胞质雄性不育性由2对隐性基因控制。Bharaj等(1995)认为野败型雄性不育受2对效力不同的恢复基因控制，其中一对强恢复基因位于第7染色体上，而弱恢复基因位于第10染色体上。Zhang等(1997)利用RAPD和RFLP分子标记技术将IR24的一个恢复基因座位Rf3定位于第1染色体RG532和RG140、RG458之间。Yao等(1997)利用RFLP分子标记技术将明恢63的两个恢复基因分别定位于第1染色体RG532与RG173之间和第10染色体长臂C234与G4003之间，已证明第10染色体长臂的基因座位的效应值大于第1染色体的恢复基因座位。张桂权等(1994)以珍汕97A、珍汕97B、IR24，以及9个以IR24为恢复基因供体、以珍汕97A为轮回亲本选育的近等基因系为材料，用随机引物扩增的方法，发现6个与育性恢复相关的RAPD分子标记；以F2群体为作图群体，通过连锁分析将与育性恢复相关的基因命名为Rf3、Rf4，并将Rf3定位于第1染色体。张群宇等(2002)用珍汕97A和恢复基因近等基因系的杂种F2分离群体中的117株完全不育株进行连锁分析，表明Rf4定位于第10染色体，从YAC4892获得的亚克隆Y38与Rf4座位的连锁距离为0.9cM，从YAC4630获得的亚克隆Y110与Rf4座位的连锁距离为3.2cM。对Rf3及Rf4恢复基因的鉴定，现有报道主要利用的标记类型为SSR和InDel标记，在育种中存在多态率较低，差异较小的缺点。检测过程中使用EB或聚炳烯酰胺易对环境造成污染，对人体产生危害。而传统育种中使用的主要鉴定方法则是通过结实率等表型观测鉴定为主，耗费时间长，且易受环境条件的限制，鉴定结果存在误差，选择效率较低。
技术实现思路
本专利技术的目的是开发一组育性恢复基因Rf3和Rf4的分子标记，其能用于Rf3和Rf4基因的鉴定及辅助选择。本专利技术水稻育性恢复基因分子标记的开发流程见图1。由于Rf3基因未被克隆，根据相关文献将Rf3基因位置确定在水稻1号染色体的5598557-6278465区间，利用Rf3的供体材料与非供体材料的重测序数据对此基因区间及其附近两侧的SNP位点进行挖掘。同时，根据已克隆的Rf4基因序列与日本晴序列进行比对，筛选SNP位点。提取候选SNP位点侧翼序列，并利用在线引物设计网站BatchPrimer3对其进行引物设计。针对这些候选SNP标记，对9份含有Rf3和Rf4基因的水稻供体品种和14份基因非供体水稻品种进行KASP反应验证，挑选出与Rf3和Rf4供体材料共分离及扩增效果好的SNP标记RSRF30121和FRF4-10-01。随后利用Rf3和Rf4供体亲本中恢8015与受体亲本内香5A的F2杂交群体进行了遗传位置验证及表型验证。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供水稻育性恢复基因辅助选择育种分子标记，包括水稻育性恢复基因Rf3辅助育种分子标记和水稻育性恢复基因Rf4辅助育种分子标记。本专利技术还提供基于KASP技术开发的用于鉴定水稻育性恢复基因的引物，包括特异引物X、特异引物Y和通用引物C，引物序列分别如SEQIDNO:1-3所示。所述分子标记是分别与水稻育性恢复基因Rf3、Rf4共分离的SNP标记RSRF30121、FRF4-10-01，标记RSRF30121检测水稻第1号染色体5606898位碱基，标记FRF4-10-01检测水稻第10号染色体18838172位碱基。基于KASP技术开发的该SNP标记RSRF30121的引物，包括特异引物X3、特异引物Y3和通用引物C3，引物序列分别如SEQIDNO:1-3所示。基于KASP技术开发的该SNP标记FRF4-10-01的引物，包括特异引物X4、特异引物Y4和通用引物C4，引物序列分别如SEQIDNO:4-6所示。本专利技术还提供含有上述引物的检测试剂或试剂盒。本专利技术还提供所述分子标记、引物、检测试剂或试剂盒在鉴定水稻育性恢复基因中的应用。本专利技术还提供所述分子标记、引物、检测试剂或试剂盒在水稻育性恢复基因辅助选择育种中的应用。本专利技术还提供所述分子标记、引物、检测试剂或试剂盒在筛选具有育性恢复基因的水稻资源中的应用。所述应用包括以下步骤：1)提取待测水稻样品的DNA；2)取20ng干燥模板DNA，100UM特异引物X0.005μl，100UM特异引物Y0.005μl，100UM通用引物C0.0125μl，2×KASPMasterMix1.4792μl，H2O1.4983μl，进行PCR扩增；3)采用荧光检测仪分析PCR扩增产物基因型。步骤2)PCR反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应：94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。步骤3)具体为：利用生物学软件对PCR扩增产物进行分型，等位位点RSRF30121-G、FRF4-10-01-G为具有育性恢复性状优异等位类型的水稻植株。采用本专利技术的引物组合能够快速鉴定水稻的育性恢复基因，对水稻材料的选择由盲目变为精确，大幅度减少了人力资源的浪费，提高了工作效率，有利于建立高效、环境友好的相关检测体系，对促进Rf3和Rf4育性恢复基因在商业化育种中的应用具有重要意义。基于KASP的基因分型方法是通过计算机记录并分析PCR过程中产生的荧光信号，实现对突变位点监测。检测结果与表现型一致，检测过程无需电泳，彻底杜绝了PCR产物的气溶胶污染、甲醛对环境的污染以及EB对人体的危害。附图说明图1为本专利技术水稻育性恢复基因辅助育种分子标记的开发流程图。图2为本专利技术实施例2中SNP标记RSRF30121在水稻第1号染色体上的遗传位置验证。图3为本专利技术实施例2中SNP标记FRF4-10-01在水稻第10号染色体上的遗传位置验证。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1水稻育性恢复基因辅助育种分子标记的获得1、引物设计根据已发表的连锁标记及与参照基因组比对，基因Rf3位于Chr.1,5598557-6278465区间。我们以基因定位区间为中心向两侧各扩大50Kb，利用3000份水稻重测序数据库提取扩大区间内SNP位点。利用基因供体与受体重测序数据进行分析，SNP位点挖掘,同时，根据已克隆的Rf4基因序列与日本晴序列进行比对，并根据PIC本文档来自技高网...

【技术保护点】
水稻育性恢复基因辅助育种分子标记，其特征在于，包括水稻育性恢复基因Rf3分子标记和水稻育性恢复基因Rf4分子标记；所述分子标记是分别与水稻育性恢复基因Rf3、Rf4共分离的SNP标记RSRF30121、FRF4‑10‑01，标记RSRF30121检测水稻第1号染色体5606898位碱基，标记FRF4‑10‑01检测水稻第10号染色体18838172位碱基；基于KASP技术开发的该SNP标记RSRF30121的引物，包括特异引物X3、特异引物Y3和通用引物C3，引物序列分别如SEQ ID NO:1‑3所示。基于KASP技术开发的该SNP标记FRF4‑10‑01的引物，包括特异引物X4、特异引物Y4和通用引物C4，引物序列分别如SEQ ID NO:4‑6所示。

【技术特征摘要】
1.水稻育性恢复基因辅助育种分子标记，其特征在于，包括水稻育性恢复基因Rf3分子标记和水稻育性恢复基因Rf4分子标记；所述分子标记是分别与水稻育性恢复基因Rf3、Rf4共分离的SNP标记RSRF30121、FRF4-10-01，标记RSRF30121检测水稻第1号染色体5606898位碱基，标记FRF4-10-01检测水稻第10号染色体18838172位碱基；基于KASP技术开发的该SNP标记RSRF30121的引物，包括特异引物X3、特异引物Y3和通用引物C3，引物序列分别如SEQIDNO:1-3所示。基于KASP技术开发的该SNP标记FRF4-10-01的引物，包括特异引物X4、特异引物Y4和通用引物C4，引物序列分别如SEQIDNO:4-6所示。2.基于KASP技术开发的用于鉴定水稻育性恢复基因Rf3的引物，其特征在于，包括特异引物X3、特异引物Y3和通用引物C3，引物序列分别如SEQIDNO:1-3所示。3.基于KASP技术开发的用于鉴定水稻育性恢复基因Rf4的引物，其特征在于，包括特异引物X4、特异引物Y4和通用引物C4，引物序列分别如SEQIDNO:4-6所示。4.含有权利要求2和/或3所述引物的检测试剂或试剂盒。5.权利要求1所述分子标记、权利要求2或3所述引物、或者权利要求4所述检测试剂或...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑秀婷，彭佩，吴云天，李宙炜，李为国，李继明，肖金华，
申请(专利权)人：华智水稻生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43