一种靶向PD‑L1嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种本发明专利技术涉及生物技术领域，具体公开了一种靶向PD‑L1嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞及其制备方法和应用。所述的靶向PD‑L1嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，其T淋巴细胞表面表达靶向PD‑L1嵌合抗原受体PD‑L1‑CAR。所述的靶向PD‑L1嵌合抗原受体PD‑L1‑CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述的靶向PD‑L1嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞不仅可在机体内通过特异性识别肿瘤细胞表面PD‑L1，介导对PD‑L1阳性肿瘤的特异性杀伤；同时可阻止PD‑1/PD‑L1免疫抑制信号通路，消除肿瘤的免疫抑制作用；从而达到特异性杀灭肿瘤的目的。

A target T PD L1 lymphocytes to chimeric antigen receptor and preparation method and application thereof

The invention discloses a the invention relates to the field of biotechnology, in particular discloses a targeted PD L1 chimeric antigen receptor T lymphocyte and its preparation method and application. T lymphocyte to PD L1 chimeric antigen receptor on the surface of the target cells expressing T targeting PD L1 chimeric antigen receptor PD L1 CAR. The target amino acid sequence of PD L1 PD L1 chimeric antigen receptor CAR such as SEQ ID NO.2 shown. T lymphocyte to PD L1 chimeric antigen receptor of the target can not only in the body through the specific recognition of tumor cell surface PD L1 mediated specific killing of PD L1 positive tumors; at the same time can prevent the PD 1/PD L1 immunosuppressive pathway, inhibition of tumor immune elimination to kill the tumor specific; thus the purpose of.

【技术实现步骤摘要】
一种靶向PD-L1嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种靶向PD-L1嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞疗法(ChimericantigenreceptorT-cellimmunotherapy，CAR-T)(JuneCH,BlazarBR,RileyJL.Engineeringlymphocytesubsets:tools,trialsandtribulations.NatRevImmunol.2009；9:704-16)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。目前为止，CAR-T细胞免疫疗法在血液肿瘤，淋巴瘤及脑胶质瘤的治疗上取得了较好的效果。而对于实体瘤，由于CAR-T细胞很难突破实体瘤的肿瘤免疫抑制微环境，CAR-T细胞免疫疗法还有待进一步优化。一般地，嵌合抗原受体CAR由一个肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区、共刺激区以及胞内信号转导区组成。CAR-T细胞疗法通过外源基因转染技术，把可特异性识别肿瘤相关抗原的单链抗体(Singlechainfragmentvariable，scFv)和T细胞活化序列的融合蛋白表达到T细胞表面，使可特异性识别肿瘤相关抗原的scFv通过跨膜区与T细胞胞内的活化增殖信号域偶联。表达CAR的T细胞以抗原依赖、但非MHC限制的方式识别肿瘤抗原，启动并活化特异性杀伤肿瘤反应。在整个免疫应答过程中，T细胞激活需要双信号通路介导。首先通过T细胞表面的T细胞受体TCR特异性识别抗原递呈细胞APC或肿瘤细胞表面的MHC分子抗原肽复合体；其次APC或肿瘤细胞上的共刺激分子与T细胞上的共刺激受体结合，激活或者抑制T淋巴细胞。T细胞上的共刺激分子主要包括共激活分子4-1BB，CD27，CD28，OX40，ICOS，以及共抑制分子CTLA4，PD-1。程序性死亡受体1(ProgrammedDeath1，PD-1)是主要表达于活化T细胞上的抑制性受体，可与其配体PD-L结合，抑制T细胞的活化与增殖，调节细胞因子的表达与分泌。目前已鉴定出2种PD1细胞表面糖蛋白配体，PD-L1和PD-L2，这两种配体在抗原递呈细胞及多种肿瘤细胞上存在高表达，并证实该配体在结合PD1后下调T细胞的激活和细胞因子的分泌(FreemanGJ,LongAJ,IwaiY,etal.EngagementofthePD-1immunoinhibitoryreceptorbyanovelB7familymemberleadstonegativeregulationoflymphocyteactivation.JExpMed.2000Oct2；192(7):1027-34)。PD-1/PD-L1信号通路主要参与自身免疫，肿瘤免疫，移植免疫等机体免疫调节过程。PD-L1是一个40KD的跨膜蛋白，在许多实体瘤中存在过表达，并且常常与较差的预后有关(OkazakiT,HonjoT.PD-1andPD-1ligands:fromdiscoverytoclinicalapplication.IntImmunol.2007Jul；19(7):813-24)。另一方面，与正常组织中的T淋巴细胞及外周血T淋巴细胞相比，肿瘤浸润性T淋巴细胞PD-1高表达。指示高表达的PD-1/PD-L1信号通路介导肿瘤的免疫抑制。(Tumorantigen-specificCD8TcellsinfiltratingthetumorexpresshighlevelsofPD-1andarefunctionallyimpaired)。目前为止，通过抑制PD-1/PD-L1信号通路，来用于肿瘤治疗在临床阶段也取得了较好的效果。百时美施贵宝(Bristol-MyersSquibb)和默沙东(MerckSharp&Dohme)的PD-L1抗体在黑色素瘤，非小细胞肺癌的临床研究上取得了较好的效果。罗氏Roche、默克Merck和辉瑞PfizerPharmaceuticals的PD-L1抗体在膀胱癌，尿路上皮癌的临床研究上也取得了较好的效果。目前，FDA已批准Roche的PD-L1抑制剂Tecentriq用于尿路上皮癌的治疗。进一步说明了抑制PD-1/PD-L1信号通路在肿瘤免疫治疗上的巨大潜力。但将PD-L1抗体整合入CAR结构，使其在T细胞表达，构建PD-L1-CAR-T细胞进行CAR-T细胞免疫疗法尚未有研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种靶向PD-L1嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，所述的靶向PD-L1嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞通过特异性识别肿瘤细胞表面PD-L1，介导对PD-L1阳性肿瘤的特异性杀伤。为实现上述目的，本专利技术通过如下技术方案予以实现：一种靶向PD-L1嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，所述T淋巴细胞表面表达靶向PD-L1嵌合抗原受体PD-L1-CAR。优选地，所述的靶向PD-L1嵌合抗原受体PD-L1-CAR的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。优选地，所述的靶向PD-L1嵌合抗原受体PD-L1-CAR的编码核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。优选地，所述的靶向PD-L1嵌合抗原受体PD-L1-CAR由GM-CSF信号肽、PD-L1抗体的单链可变区(Anti-PD-L1scFv)、CD8α铰链区(Hinge)、CD8α跨膜区(transmembranedomain)、4-1BB共刺激信号域(co-stimulatorysignaldomain)以及CD3ζ胞内信号域(signaldomain)串联组成；其中PD-L1抗体的单链可变区(Anti-PD-L1scFv)是由重链可变区序列(PD-L1heavychainscFv)和轻链可变区序列(PD-L1lightchainscFv)通过(Gly4-Ser)n(linker)串联组成。进一步优选地，所述的GM-CSF信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；所述的CD8α铰链区(Hinge)的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示；所述的CD8α跨膜区的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示；所述的4-1BB共刺激信号域(co-stimulatorysignaldomain)的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示；所述的CD3ζ胞内信号域(signaldomain)的氨基酸序列如SEQIDNO.12所示；所述的轻链可变区序列(PD-L1lightchainscFv)的氨基酸序列如SEQIDNO.14所示；所述的重链可变区序列(PD-L1heavychainscFv)的氨基酸序列如SEQIDNO.16所示；所述的(Gly4-Ser)n的氨基酸序列如SEQIDNO.18所示。进一步优选地，所述的GM-CSF信号肽的编码核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述的CD8α铰链区(Hinge)的编码核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；所述的CD8α跨膜区的编码核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；所述的4-1BB共刺激信号域(co-stimulatorysignaldomain)的编码核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；所述的CD3ζ胞内信号域(sign本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向PD‑L1嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，其特征在于，所述T淋巴细胞表面表达靶向PD‑L1嵌合抗原受体PD‑L1‑CAR。

【技术特征摘要】
1.一种靶向PD-L1嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，其特征在于，所述T淋巴细胞表面表达靶向PD-L1嵌合抗原受体PD-L1-CAR。2.根据权利要求1所述的靶向PD-L1嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，其特征在于，所述的靶向PD-L1嵌合抗原受体PD-L1-CAR的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求1所述的靶向PD-L1嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，其特征在于，所述的靶向PD-L1嵌合抗原受体PD-L1-CAR的编码核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。4.根据权利要求1所述的靶向PD-L1嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，其特征在于，所述的靶向PD-L1嵌合抗原受体PD-L1-CAR由GM-CSF信号肽、PD-L1抗体的单链可变区、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、4-1BB共刺激信号域以及CD3ζ胞内信号域串联组成；其中PD-L1抗体的单链可变区是由重链可变区序列和轻链可变区序列通过(Gly4-Ser)n串联组成。5.根据权利要求4所述的的靶向PD-L1嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，其特征在于，所述的GM-CSF信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；所述的CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示；所述的CD8α跨膜区的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示；所述的4-1BB共刺激信号域的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示；所述的CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQIDNO.12所示；所述的轻链可变区序列的氨基酸序列如SEQIDNO.14所示；所述的重链可变区序列的氨基酸序列如SEQIDNO.16所示；所述的(Gly4-Ser)n的氨基酸序列如SEQIDNO.18所示。6.根据权利要求4所述的的靶向PD-L1嵌合抗原受体修饰的T淋...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊克兴，高同同，
申请(专利权)人：时力生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11